Analyse immunologischer Merkmale auf Basis von Einzelzell-RNA-Sequenzierung bei einem COVID-19-Patienten mit wiederkehrend positiver SARS-CoV-2-RNA
Seit dem Ausbruch im Dezember 2019 hat das schwere akute respiratorische Syndrom-Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) weltweit über 2,4 Milliarden Menschen infiziert und zu mehr als 4,9 Millionen Todesfällen geführt. Um die Pathogenese der SARS-CoV-2-Infektion zu verstehen, wurden Einzelzell-RNA-Sequenzierungsprofile (scRNA-seq) von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) bei COVID-19-Patienten in verschiedenen Krankheitsstadien erstellt. Diese Daten zeigten bei moderaten Verläufen eine typische Interferonantwort und die Expansion zytotoxischer Effektor-T-Zell-Subsets. Bei schweren Verläufen waren Plasmablasten und eine nicht-kanonische Neutrophilensubpopulation bei Patienten mit akutem Atemnotsyndrom erhöht. Im Gegensatz dazu wiesen Patienten in der Genesungsphase vermehrt Plasmazellen mit neuartigen B-Zell-Rezeptor-Veränderungen auf.
Eine Metaanalyse von 5182 genesenden Patienten ergab, dass die kumulative Rate wiederkehrender RNA-Positivität 12 % (95 %-KI: 12 %–13 %) nach 1 bzw. 2 Monaten nach Entlassung betrug. Um die zugrunde liegenden immunologischen Merkmale zu untersuchen, analysierten wir mittels scRNA-seq das transkriptomische Immunprofil von PBMCs eines genesenden Patienten mit wiederkehrend positiver RNA in Rachenabstrichen. Durch quantitative PCR wurde die SARS-CoV-2-RNA-Positivität bei diesem Patienten 14 Tage nach Entlassung nachgewiesen und persistierte über weitere 8 Wochen. Als Kontrollen dienten genesende COVID-19-Patienten (n = 15) mit negativer SARS-CoV-2-RNA sowie verstorbene Patienten (n = 4).
Die allgemeinen Charakteristika der Studienkohorte sind in Zusatzmaterial Tabelle 1 dargestellt. Bei den 20 analysierten COVID-19-Patienten betrug das durchschnittliche Alter 65,1 Jahre (Spanne: 33–92 Jahre), darunter 8 Frauen. Nach Schweregrad klassifiziert, litten 3 Patienten an einem moderaten, 12 an einem schweren und 5 an einem kritischen Verlauf. Da einer der drei Patienten mit moderatem Verlauf wiederkehrende RNA-Positivität aufwies, wurde der B-Zell-Rezeptor (BCR) dieser Patienten mittels 10x-Plattform sequenziert. Der T-Zell-Rezeptor (TCR) aller Patienten wurde ebenfalls analysiert, wobei ein Sample aufgrund einer geringen Zellleserate („low fraction reads in cells“) ausgeschlossen wurde (Abbildung 1A).
In PBMC-Proben wurden keine Virusreads detektiert. Nach Sequenzverarbeitung und Qualitätskontrolle entstand ein Immunatlas aus 267.901 hochwertigen Zelltranskriptomen (durchschnittlich 14.100 PBMCs pro Sample). Clusteranalysen und Normalisierung erfolgten auf Basis der Genexpressionsmatrizen. Zur Visualisierung wurde eine UMAP-Dimensionalitätsreduktion durchgeführt. Anhand kanonischer Zellmarker und differenziell exprimierter Gene (DEGs) wurden acht Hauptzelltypen identifiziert: T-Zellen (CD3D, CD3E), B-Zellen (CD79A), NK-Zellen (NKG7, GNLY, FCGR3A), Monozyten (CD14, FCGR3A), monozyten-abgeleitete dendritische Zellen (MO-DCs; CD1C), plasmazytoide dendritische Zellen (pDCs; IL3RA, GZMB), hämatopoetische Stammzellen (CYTL1) und Thrombozyten (PPBP, PF4, GP9). Ein Pearson-Chi-Quadrat-Test zeigte, dass die Anteile von B-Zellen und NK-Zellen beim Rezidivpatienten im Vergleich zu genesenen oder verstorbenen Patienten reduziert, die Anteile von T-Zellen, Monozyten, MO-DCs und pDCs jedoch erhöht waren (korrigiertes P < 0,05).
Zur Subklassifizierung von Zellpopulationen wurde das Tool SingleR eingesetzt. Hauptzelltypen (>5 % Häufigkeit) wurden reclustert und annotiert. B-Zellen wurden anhand klassischer Marker in Prä-B-Zellen (IL7R+), unreife B-Zellen (CD37+, MS4A1+), naive B-Zellen (MS4A1+, IGHD+), Gedächtnis-B-Zellen (CD27+, BLNK+), Plasmazellen (MZB1+, IGHG1+, TNFRSF17+) und proliferierende Plasmazellen (MZB1+, IGHG1+, TNFRSF17+, MKI67+) unterteilt (Abbildung 1B). Beim Rezidivpatienten waren die Häufigkeiten von Prä-B-Zellen (30-fach), unreifen B-Zellen (8,7-fach), naiven B-Zellen (1,7-fach) und Plasmazellen (9,2-fach) im Vergleich zu Genesenden reduziert, während Gedächtnis-B-Zellen und proliferierende Plasmazellen signifikant erhöht waren (Abbildung 1C).
Die BCR-Repertoireanalyse (10x Genomics) von drei moderaten Fällen umfasste 2192 B-Zellen mit produktiver Schwerketten- (IGH) und Leichtketten- (IGL/IGK) Expression. Die BCR-Detektionsrate betrug beim Rezidivpatienten 56,7 % vs. 76,4 % bei Genesenden (P < 0,05; Abbildung 1D). Während das BCR-Repertoire der Genesenden kaum klonale Expansion zeigte, wies der Rezidivpatient nur einen klonalen Doppelbefund unter 610 Klonotypen auf. CDR3-Sequenzen waren in den Top-IGL/IGK-Pools, nicht jedoch in IGH-Pools, gruppenübergreifend geteilt. Beim Rezidivpatienten bestand eine Längenvarianz von CDR3 in IGH (P < 0,0001) sowie eine abweichende VJ-Paarung (IGKV1-5 ~ IGKJ1 vs. IGKV3-20 ~ IGKJ2 bei Genesenden; Abbildung 1E). Zudem waren die anti-S1S2-, anti-RBD- und anti-N-Protein-Antikörpertiter beim Rezidivpatienten erniedrigt (Abbildung 1F), was auf eine gestörte B-Zell-Entwicklung und -Funktion hinweist.
Eine Gen-Set-Enrichment-Analyse (GSEA) der DEGs offenbarte eine Reduktion des Toll-like-Rezeptor-4-Signalwegs (notwendig für B-Zell-Aktivierung) in unreifen B-Zellen, naiven B-Zellen und proliferierenden Plasmazellen des Rezidivpatienten (P < 0,05, NES < 0). Ebenso waren die NF-κB-Signalwege (essenziell für B-Zell-Überleben und Reifung) sowie BCR- und FcεR1-Signalwege supprimiert (Abbildung 1G–I).
Zusammenfassend demonstrieren unsere Daten eine beeinträchtigte B-Zell-Entwicklung, -Proliferation und -Funktion beim Rezidivpatienten, bedingt durch verminderte Antigenerkennung. Mechanistisch tragen reduzierte TNF/TNF-Rezeptor-Pfade, NF-κB-Aktivierung und PLAUR/Integrin-αMβ2-Signalwege zu diesen Defiziten bei.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000001956