Exosomales miR-485-3p aus pankreatischen Gangepithelzellen hemmt die Metastasierung von Pankreaskarzinomen durch Targeting von PAK1
Einleitung
Zellkonkurrenz ist ein biologisches Phänomen, bei dem verschiedene Zelltypen innerhalb eines Gewebes um Überleben und Wachstum konkurrieren. Dieser Prozess spielt eine entscheidende Rolle bei der Homöostase von Organen, der Aufrechterhaltung der Immunfunktion und der Tumorentwicklung. Beim Pankreaskarzinom (PC) umfasst die Zellkonkurrenz Interaktionen zwischen Pankreaskarzinomzellen, pankreatischen Sternzellen (PSCs) und normalen pankreatischen Gangepithelzellen. Die Mechanismen, die dieser Konkurrenz zugrunde liegen, sind jedoch noch weitgehend unverstanden.
Exosomen, nanoskalige extrazelluläre Vesikel, die von fast allen Zelltypen freigesetzt werden, haben sich als wichtige Vermittler der Zell-zu-Zell-Kommunikation erwiesen. Sie transportieren verschiedene Biomoleküle, einschließlich MicroRNAs (miRNAs), die die Genexpression regulieren und die Krebsprogression beeinflussen. Während sich die meisten Studien auf Exosomen aus Tumor- oder Stromazellen konzentriert haben, deuten neuere Erkenntnisse darauf hin, dass Exosomen aus normalen Zellen ebenfalls das Krebsverhalten modulieren können. Beispielsweise hemmt das exosomale lange nicht-kodierende RNA PTENP1 aus normalen Blasenzellen die Malignität von Krebszellen. Diese Studie untersucht, ob exosomale miRNAs aus normalen pankreatischen Gangepithelzellen die Progression von Pankreaskarzinomen unterdrücken können.
Methoden
Klinische Proben wurden von 46 Patienten, bei denen zwischen 2013 und 2017 am Peking University First Hospital ein Pankreaskarzinom diagnostiziert wurde, entnommen. Die Gewebeproben wurden in flüssigem Stickstoff gelagert, und die ethische Genehmigung wurde eingeholt. Menschliche pankreatische Sternzellen (PSCs) wurden aus resezierten PC-Geweben isoliert, während normale pankreatische Gangepithelzellen (hTERT-HPNE) und PC-Zelllinien (AsPC-1, BxPC-3, MIA PaCa-2, PANC-1, Patu8988, T3M4) unter Standardbedingungen kultiviert wurden.
Exosomen wurden aus hTERT-HPNE, PSCs und PC-Zelllinien mittels Ultrazentrifugation oder ExoQuick-tc-Kits isoliert. Die Morphologie und Größenverteilung der Exosomen wurde mittels Transmissionselektronenmikroskopie und Nanopartikel-Tracking-Analyse untersucht. Exosomale Marker wie CD9, CD63 und TSG101 wurden durch Western Blot nachgewiesen.
Die Zellproliferation wurde mittels CCK-8-Assays bewertet, während Migration und Invasion durch Transwell-Assays untersucht wurden. Exosomen wurden mit PKH-67 markiert, um ihre Aufnahme in Empfängerzellen zu verfolgen. RNA-Isolierung und Echtzeit-PCR wurden durchgeführt, um die Expression von miR-485-3p und PAK1 zu messen. Dual-Luciferase-Reporter-Assays wurden durchgeführt, um die Bindung von miR-485-3p an die 3′-untranslatierten Region (3’UTR) von PAK1 zu validieren.
Für In-vivo-Studien wurden BxPC-3-Zellen, die mit miR-485-3p-Mimik oder Inhibitor transfiziert wurden, in Nacktmäuse injiziert, um die Metastasierung zu bewerten. Biolumineszenzbildgebung und Immunhistochemie wurden verwendet, um das Tumorwachstum und die PAK1-Expression zu beurteilen.
Ergebnisse
Exosomen aus hTERT-HPNE hemmen die Migration und Invasion von PC-Zellen
Exosomen, die aus hTERT-HPNE isoliert wurden (ExohTERT-HPNE), zeigten eine typische exosomale Morphologie und Größenverteilung. PKH-67-markierte ExohTERT-HPNE wurden von PC-Zellen (BxPC-3 und PANC-1) und PSCs aufgenommen, was durch konfokale Mikroskopie bestätigt wurde. Während ExohTERT-HPNE die Proliferation von PC-Zellen nicht beeinflussten, hemmten sie signifikant die Migration und Invasion in BxPC-3- und PANC-1-Zellen.
Exosomen aus hTERT-HPNE hemmen die Migration und Sekretion von PSCs
ExohTERT-HPNE unterdrückten auch die Migration von PSCs, ohne deren Proliferation zu beeinflussen. Darüber hinaus regulierten ExohTERT-HPNE die Sekretion von Fibronectin 1 (FN1), Kollagen Typ Alpha-1-Kette (COLIA1) und Fibroblasten-Aktivierungsprotein Alpha (FAP) in PSCs herunter, Schlüsselfaktoren, die zum PC-Stroma und zum immunsuppressiven Mikromilieu beitragen.
Exosomales miR-485-3p ist in PC-Zellen und PSCs herunterreguliert
miRNA-Sequenzierung zeigte, dass miR-485-3p in ExohTERT-HPNE angereichert war, jedoch in Exosomen aus PSCs und PC-Zellen fehlte. RT-PCR bestätigte niedrigere miR-485-3p-Spiegel in PSCs und PC-Zellen im Vergleich zu normalen pankreatischen Gangepithelzellen. Klinische Daten zeigten, dass miR-485-3p in 78,3% der PC-Gewebe signifikant verringert war und negativ mit der lymphovaskulären Invasion assoziiert war.
ExohTERT-HPNE übertrugen reifes miR-485-3p in PC-Zellen und PSCs, wie durch erhöhte miR-485-3p-Spiegel in den Empfängerzellen belegt wurde. Dies deutet darauf hin, dass ExohTERT-HPNE miR-485-3p direkt übertragen, anstatt dessen Produktion zu stimulieren.
MiR-485-3p reguliert die Migration und Invasion von PC-Zellen
Die Überexpression von miR-485-3p in BxPC-3- und PANC-1-Zellen hemmte die Migration und Invasion, während die Silenzierung von miR-485-3p den gegenteiligen Effekt hatte. In PSCs beeinflusste die Überexpression oder Silenzierung von miR-485-3p die Migration nicht signifikant, veränderte jedoch leicht die COLIA1-Sekretion.
Die Hochregulierung von miR-485-3p verstärkt die hemmenden Effekte von ExohTERT-HPNE
Die Überexpression von miR-485-3p in hTERT-HPNE verstärkte die hemmenden Effekte von ExohTERT-HPNE auf die Migration und Invasion von PC-Zellen. Umgekehrt hob die Knockdown von miR-485-3p diese Effekte nicht auf, was darauf hindeutet, dass miR-485-3p nicht der einzige Vermittler der ExohTERT-HPNE-Aktivität ist.
MiR-485-3p zielt direkt auf PAK1 ab, um die PC-Metastasierung zu unterdrücken
Bioinformatische Analysen identifizierten PAK1 als potenzielles Ziel von miR-485-3p. Dual-Luciferase-Reporter-Assays bestätigten die Bindung von miR-485-3p an die 3’UTR von PAK1. In PC-Geweben waren die miR-485-3p-Spiegel negativ mit der PAK1-Expression korreliert. ExohTERT-HPNE und miR-485-3p-Mimik reduzierten die PAK1-Expression in BxPC-3-Zellen, während der miR-485-3p-Inhibitor sie erhöhte.
In-vivo-Studien zeigten, dass die Überexpression von miR-485-3p die PC-Metastasierung hemmte und die PAK1-Spiegel in Lungengeweben reduzierte, während die Silenzierung von miR-485-3p die Metastasierung förderte und die PAK1-Expression erhöhte.
MiR-485-3p vermittelt die hemmenden Effekte von ExohTERT-HPNE über PAK1
Die stabile Überexpression von PAK1 in BxPC-3-Zellen stellte die durch ExohTERT-HPNE unterdrückte Migration und Invasion wieder her. Die Hemmung von miR-485-3p verstärkte weiterhin die PAK1-Expression und verstärkte diese Effekte. Dies bestätigt, dass miR-485-3p die hemmenden Effekte von ExohTERT-HPNE durch Targeting von PAK1 vermittelt.
Diskussion
Diese Studie enthüllt einen neuartigen Mechanismus der Zellkonkurrenz beim Pankreaskarzinom, bei dem normale pankreatische Gangepithelzellen Exosomen freisetzen, die miR-485-3p enthalten, um die malignen Verhaltensweisen von PC-Zellen und PSCs zu unterdrücken. Exosomales miR-485-3p zielt direkt auf PAK1 ab und hemmt die Migration, Invasion und Metastasierung von PC-Zellen.
PAK1, eine Serin/Threonin-Kinase, ist beim Pankreaskarzinom hochreguliert und fördert die Tumorprogression. Durch die Herunterregulierung von PAK1 entfaltet miR-485-3p antitumorale Effekte, was sein Potenzial als therapeutisches Ziel unterstreicht. Die Wiederherstellung von miR-485-3p durch Exosomen oder andere Liefervehikel könnte einen neuartigen Ansatz für die Behandlung von Pankreaskarzinomen bieten.
Während miR-485-3p eine zentrale Rolle bei der Vermittlung der Effekte von ExohTERT-HPNE spielt, könnten auch andere Moleküle innerhalb dieser Exosomen zu ihrer hemmenden Aktivität beitragen. Weitere Forschung ist erforderlich, um zusätzliche Faktoren zu identifizieren, die an diesem Prozess beteiligt sind.
Schlussfolgerung
Exosomales miR-485-3p aus normalen pankreatischen Gangepithelzellen hemmt die Metastasierung von Pankreaskarzinomen durch Targeting von PAK1. Diese Entdeckung unterstreicht die Bedeutung der Zellkonkurrenz bei der Tumorprogression und bietet eine Grundlage für die Entwicklung von miR-485-3p-basierten Therapien für Pankreaskarzinome.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000002154