Identifizierung und Charakterisierung einer neuen Gruppe natürlicher Antisense-Transkripte aus dem RNA1.2-Genlokus des humanen Zytomegalievirus
Natürliche Antisense-Transkripte (NATs) sind RNA-Moleküle, die vom komplementären DNA-Strand annotierter Gene transkribiert werden. Diese Transkripte spielen eine bedeutende Rolle bei der Regulation der Genexpression auf prä-transkriptioneller, transkriptioneller und post-transkriptioneller Ebene. Trotz ihrer weiten Verbreitung in verschiedenen Spezies war die Antisense-Transkription des RNA1.2-Genlokus im humanen Zytomegalievirus (HCMV) vor dieser Studie nicht untersucht worden. Ziel dieser Forschung war die Identifizierung und Charakterisierung von NATs aus dem RNA1.2-Genlokus in einem klinisch isolierten HCMV-Stamm.
Das humane Zytomegalievirus gehört zur Familie der Beta-Herpesviren und besitzt ein Genom von 230 bis 240 Kilobasen. HCMV-Infektionen verlaufen bei gesunden Personen meist asymptomatisch, können jedoch bei immungeschwächten Patienten und Neugeborenen schwerwiegende Komplikationen verursachen. Das Virus kodiert eine Vielzahl von RNAs, einschließlich nicht-kodierender RNAs (ncRNAs), denen zunehmend kritische Funktionen im viralen Lebenszyklus und in Immunreaktionen zugeschrieben werden. RNA1.2 zählt zu den am stärksten exprimierten viralen Transkripten und macht einen Großteil der polyadenylierten viralen RNA aus. Obwohl RNA1.2 primär als lange nicht-kodierende RNA (lncRNA) betrachtet wird, deuten jüngste Erkenntnisse auf eine mögliche Kodierung eines Polypeptids hin.
In der Studie wurde eine strand-spezifische Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung (RNA-seq) eingesetzt, um potenzielle Antisense-Transkripte (ASTs) des RNA1.2-Genlokus zu identifizieren. RNA wurde aus mit dem HCMV-Isolat HAN infizierten menschlichen embryonalen Lungenfibroblasten (HELFs) extrahiert. Die RNA-seq-Daten wurden mithilfe der Integrative Genomics Viewer (IGV)-Software analysiert und visualisiert. Zur Bestätigung der Transkriptpräsenz kamen Northern-Blot-Analyse und rapid amplification of cDNA ends (RACE) zum Einsatz.
Die RNA-seq-Analyse zeigte Transkription vom Gegenstrand des RNA1.2-Genlokus, was auf NATs hindeutete. Drei distinkte HCMV-NATs – RNA1.2 AST1, RNA1.2 AST2 und RNA1.2 AST3 – wurden charakterisiert. Diese Transkripte stammen vom komplementären Strand des RNA1.2-Lokus und werden vorwiegend in der Spätphase der HCMV-Infektion exprimiert. Die 5′- und 3′-Termini dieser Transkripte lagen innerhalb der Gegenstrangsequenz des vorhergesagten RNA1.2-Gens.
Die Northern-Blot-Analyse bestätigte die NATs durch drei Banden von etwa 1100, 1000 und 600 Nukleotiden in der 72 Stunden post Infektion (hpi)-RNA-Probe. In Proben von 24 hpi, 48 hpi oder nicht infizierten Zellen fehlten diese Banden, was auf eine spezifische Induktion in der Spätphase hindeutet. Ein weiteres Transkript von ca. 1,2 Kilobasen wurde mittels RNA1.2-spezifischer Sonde nachgewiesen, was die Sense-Strang-Transkription bestätigte.
RACE-Analysen bestimmten die exakten 5′- und 3′-Enden der RNA1.2-ASTs. Die 3′-RACE ergab zwei vorherrschende Banden (ca. 400 und 250 Basenpaare), wobei die Sequenzierung die 3′-Enden an den Nukleotidpositionen 8062–8093 und 7843–7855 zeigte – downstream eines konservierten Polyadenylierungs-Signals (AATAAA) an Position 7843–7848. Die 5′-RACE identifizierte drei Banden (ca. 500, 350 und 250 Basenpaare) mit Startpunkten an den Positionen 7479, 7331 und 7203 des HCMV-HAN-Genoms, jeweils downstream einer putative „TATA“-Box ab Position 7074.
Die Studie identifizierte mindestens drei RNA1.2-ASTs mit unterschiedlichen Termini. Es handelt sich um interne NATs, die vollständig vom Sense-Transkript des RNA1.2-Gens überlappt werden. Die RNA1.2-ASTs sind polyadenyliert (3′-RACE-bestätigt) und zytoplasmatisch lokalisiert, wo sie mit ihren überlappenden Sense-RNs interagieren könnten. Ihre Häufigkeit war deutlich geringer als die von RNA1.2, was mit der generell niedrigeren NAT-Expression konsistent ist.
Die variablen Transkriptionsstoppstellen der RNA1.2-ASTs deuten auf komplexe Regulationsmechanismen hin. Während RNA1.2 AST3 an einem kanonischen Polyadenylierungs-Signal endet, terminieren RNA1.2 AST1 und AST2 über 250 Nukleotide downstream, möglicherweise durch Read-through-Transkription – ein Phänomen, das auch bei anderen Herpesviren beobachtet wurde.
Die Initiationsstellen der RNA1.2-ASTs liegen downstream einer putative „TATA“-Box. Die hohe CG-Konzentration upstream des Transkriptionsstarts (TSS) von RNA1.2 AST1 legt unterschiedliche Regulationsmechanismen nahe. Die Studie postuliert eine Rolle der RNA1.2-ASTs in der Regulation der RNA1.2-Expression, deren genaue Funktion jedoch weiterer Untersuchungen bedarf.
Zusammenfassend charakterisiert diese Studie erstmals eine neue Gruppe von NATs aus dem RNA1.2-Lokus des HCMV. Diese Transkripte sind differenziell reguliert und könnten im viralen Lebenszyklus durch Modulation der RNA1.2-Expression eine Rolle spielen. Die Ergebnisse bilden eine Grundlage für zukünftige Forschungen zu den biologischen Funktionen dieser NATs und ihren Implikationen für HCMV-Infektionen.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000000299