In-silico-Bewertung der Auswirkungen genomischer Variationen des neuartigen Coronavirus 2019 auf die Effizienz veröffentlichter Echtzeit-Quantitative-Polymerase-Kettenreaktion-Nachweisverfahren
Der Ausbruch der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19), verursacht durch das neuartige Coronavirus 2019 (2019-nCoV), trat im Dezember 2019 in Wuhan, China, auf und entwickelte sich zu einer globalen Gesundheitskrise. Die Echtzeit-Quantitative-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) wurde als effektive Methode zur Pathogendetektion empfohlen und spielte eine entscheidende Rolle bei der Pandemiebekämpfung. Allerdings kann die Effizienz von RT-qPCR erheblich reduziert werden, wenn Varianten in den Primerregionen liegen, was zu falsch-negativen Ergebnissen führen kann. Dies unterstreicht die Notwendigkeit einer umfassenden Analyse der genomischen Variationen von 2019-nCoV, um die Zuverlässigkeit bestehender RT-qPCR-Verfahren zu bewerten.
In dieser Studie wurden 77 vollständige Genomsequenzen von 2019-nCoV aus der GISAID-Datenbank mittels MAFFT Version 7.450 aligniert. Es wurden insgesamt 85 Variantenstellen identifiziert, darunter sieben Stellen, die in zwei Sequenzen auftraten, und neun Stellen, die in drei oder mehr Sequenzen konserviert waren. Diese Variationen wurden hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf 13 RT-qPCR-Primersets von acht Institutionen untersucht, die Gene wie ORF1ab, Spike (S), Hüllprotein (E) und Nukleokapsid (N) targetieren.
Die Analyse zeigte, dass die Reverse-Primer der Primer-Sets 3 und 6 eine Fehlpaarung gegenüber allen veröffentlichten 2019-nCoV-Sequenzen aufwiesen. Drei spezifische Variantenstellen (Positionen 28291, 28688 und 29200 im Referenzgenom IVDC-HB-01) befanden sich in den Forward-Primern der Sets 7 und 9 sowie in der Sonde von Set 8. Diese Varianten traten in den Sequenzen BetaCoV/Shenzhen/SZTH-003/2020, BetaCoV/Shandong/IVDC-SD-001/2020jEPI_ISL_408482 und BetaCoV/Chongqing/YC01/2020jEPI_ISL_408478 auf. Variationen in der Sondenregion von Set 8 können die Detektionseffizienz aufgrund früherer Erkenntnisse besonders beeinträchtigen.
Fünf Primer-Sets (3, 6, 7, 8 und 9) bergen das Risiko falsch-negativer Ergebnisse. Drei dieser Sets mit Varianten im N-Gen unterstreichen die Bedeutung der Zielgenauswahl: Konservierte Regionen wie das nsp12-Gen (RdRp) sind vorzuziehen. Obwohl Multiplex-Targeting das Risiko verringern kann, sind regelmäßige Leistungsbewertungen der Primer und kontinuierliche Genomüberwachung unerlässlich.
Die Studie betont die Notwendigkeit fortlaufender genomischer Surveillance, um die Zuverlässigkeit diagnostischer Methoden während einer dynamischen Pandemie zu gewährleisten. Die Identifizierung von Varianten in Primer- und Sondenregionen erfordert periodische Anpassungen der RT-qPCR-Assays. Falsch-negative Ergebnisse aufgrund genomischer Variationen könnten die Diagnose und Ausbruchskontrolle erheblich beeinflussen.
Zusammenfassend zeigt diese In-silico-Analyse, dass genomische Variationen von 2019-nCoV die RT-qPCR-Detektion beeinträchtigen können. Die Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung sorgfältiger Primerauswahl, Aktualisierungen der Assays und systematischer Genomüberwachung. Durch diese Maßnahmen kann die Genauigkeit der 2019-nCoV-Detektion verbessert und die Effektivität von Kontrollstrategien gesteigert werden.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000000817