Zwei natürlich abgeleitete niedermolekulare Verbindungen unterbrechen die SIX1-EYA1-Interaktion und hemmen das Wachstum kolorektaler Krebszellen
Kolorektalkarzinome (CRC) bleiben eine Hauptursache für krebsbedingte Morbidität und Mortalität weltweit. Trotz Fortschritten in Therapiemodalitäten wie Chemotherapie, Radiotherapie und zielgerichteten Therapien bestehen Herausforderungen wie Arzneimittelresistenz und unspezifische Wirkungen. Neuere Studien beleuchten die onkogenen Rollen transkriptioneller Komplexe bei Tumorprogression und Metastasierung. Dabei hat die Interaktion zwischen dem SINEOCULIS-Homeobox-Homolog 1 (SIX1) und dem EYES-ABSENT-Homolog 1 (EYA1) eine zentrale Rolle in der Tumorgenese erlangt. Diese Studie untersuchte die Funktion des SIX1-EYA1-Komplexes in der CRC-Pathogenese, identifizierte niedermolekulare Inhibitoren dieser Interaktion und evaluierte ihr therapeutisches Potenzial.
Überexpression von SIX1 und EYA1 im kolorektalen Karzinom
Der SIX1-EYA1-Transkriptionskomplex war in CRC-Geweben signifikant stärker exprimiert als in angrenzendem nicht-kanzerösem Gewebe. In einer Kohorte von 24 CRC-Patienten lagen die mRNA-Level von SIX1 bei 7,47 ± 3,54 in Tumoren vs. 1,88 ± 0,35 in Kontrollen (t = 4,92; P = 0,008), während EYA1-Level 7,61 ± 2,03 vs. 2,22 ± 0,45 betrugen (t = 6,73; P = 0,005). Western-Blot-Analysen bestätigten erhöhte Proteinlevel von SIX1 (2,73 ± 0,24-fach), EYA1 (2,45 ± 0,17-fach), Cyclin A1 (CCNA1; 2,68 ± 0,21-fach) und TGF-β (3,68 ± 0,44-fach) in CRC-Geweben. Ähnliche Überexpressionsmuster zeigten sich in CRC-Zelllinien, insbesondere HT29 und SW620. In HT29-Zellen waren SIX1– und EYA1-mRNA-Level um 4,34 ± 0,35-fach bzw. 4,13 ± 0,39-fach höher als in nicht-kanzerösen Kolonepithelzellen (HCEC-1CT). Kaplan-Meier-Analysen von TCGA-Daten ergaben, dass eine hohe Expression von SIX1 oder EYA1 mit schlechterem Gesamtüberleben bei CRC-Patienten korrelierte.
Der SIX1-EYA1-Komplex aktiviert onkogene Zielgene CCNA1 und TGFB1
Ko-Immunpräzipitation (Co-IP) und Immunfluoreszenz-Assays bestätigten die direkte Interaktion und nukleäre Kolokalisation von SIX1 und EYA1 in CRC-Geweben und -Zellen. Der Komplex regulierte transkriptionell zwei Schlüssel-Onkogene: CCNA1 (3,12-fach hochreguliert in Tumoren) und TGFB1 (6,04-fach hochreguliert). Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) zeigte die Bindung des SIX1-EYA1-Komplexes an MEF3-Konsensusstellen in den Promotoren von CCNA1 und TGFB1. Knockdown (KD) von SIX1 oder EYA1 mittels lentiviraler shRNAs reduzierte mRNA- und Proteinlevels von CCNA1 und TGF-β in CRC-Zellen, während Überexpression (OE) deren Expression steigerte. Luciferase-Reporter-Assays validierten, dass die SIX1-abhängige Aktivierung dieser Promotoren intakte MEF3-Bindungsstellen erfordert.
Funktionelle Folgen des SIX1/EYA1-Knockdowns
Die Depletion von SIX1 oder EYA1 in HT29-Zellen beeinträchtigte onkogene Phänotypen signifikant. SIX1-KD-Zellen zeigten eine 70%ige Reduktion der Proliferation (MTT-Assay), 80% weniger Kolonien (klonogener Assay) und 75% geringere Invasion (Boyden-Kammer-Assay) im Vergleich zu Kontrollen. Ähnliche Reduktionen (65%, 78%, 70%) traten bei EYA1-KD-Zellen auf. Die Überexpression von SIX1 oder EYA1 steigerte Proliferation und Invasion moderat, was ihre onkogene Rolle unterstreicht. In Xenograft-Modellen waren Tumore aus SIX1-KD- oder EYA1-KD-Zellen um 60–70% kleiner als Kontrollen. Rescue-Experimente durch OE von CCNA1 oder TGFB1 in KD-Zellen stellten die proliferative Kapazität teilweise wieder her, was deren Rolle als downstream-Effektoren bestätigte.
Identifizierung von NSC0191 und NSC0933 als SIX1-EYA1-Interaktionsinhibitoren
Ein High-Throughput-AlphaScreen-Assay mit 2.000 Verbindungen identifizierte Inhibitoren der SIX1-EYA1-Interaktion. Rekombinante GST-SIX1- und His-EYA1-Proteine wurden unter optimierten Bedingungen (120 nM GST-SIX1, 100 nM His-EYA1) eingesetzt. Die Verbindungen NSC0191 und NSC0933 hemmten die Interaktion mit IC50-Werten von 12,60 ± 1,15 µM bzw. 83,43 ± 7,24 µM. In-vitro-Pulldown-Assays bestätigten eine dosisabhängige Unterbrechung der Bindung. Bei 20 µM blockierte NSC0191 80,15% der Interaktionen, während 160 µM NSC0933 70,33% hemmten.
Antitumorale Effekte von NSC0191 und NSC0933
In HT29-Zellen reduzierten NSC0191 (10–20 µM) und NSC0933 (80–160 µM) die CCNA1- und TGF-β-Proteinlevel um 50–80%, ohne SIX1- oder EYA1-Expression zu beeinflussen. Co-IP-Assays zeigten, dass 20 µM NSC0191 die EYA1-Bindung an SIX1 um 75% verringerte, während 160 µM NSC0933 eine 60%ige Reduktion bewirkte. Funktionell hemmten die Inhibitoren dosisabhängig die Proliferation (45–80% Reduktion), Koloniebildung (60–85% weniger Kolonien) und Invasion (50–75% weniger Zellen).
In Maus-Xenograft-Modellen reduzierten wöchentliche intraperitoneale Injektionen von NSC0191 (10–20 µM) oder NSC0933 (80–160 µM) die Tumorvolumina nach 30 Tagen um 48–80%. Immunhistochemie behandelter Tumoren zeigte verminderte CCNA1- und TGF-β-Expression bei unveränderten SIX1/EYA1-Leveln, konsistent mit In-vitro-Daten.
Mechanismus und therapeutische Implikationen
Der SIX1-EYA1-Komplex fördert die CRC-Progression durch Transaktivierung von CCNA1 (Zellzyklusregulator) und TGFB1 (pro-metastatisches Zytokin). NSC0191 und NSC0933 unterbrechen diese Interaktion, blockieren die transkriptionelle Aktivierung und downstream-Onkogensignalwege. Die Verbindungen zeigten minimale Toxizität in nicht-kanzerösen Zellen, was auf eine selektive Targeting-Strategie hindeutet.
Einschränkungen umfassen unerforschte Rollen anderer EYA-Familienmitglieder (EYA3/EYA4) in CRC und die Notwendigkeit pharmakokinetischer Optimierung der Inhibitoren. Zukünftige Studien werden Kombinationstherapien mit Chemotherapeutika und Wirksamkeit in patientenabhängigen Xenografts evaluieren.