Unterdrückung von Smad3 durch Silencing von Robo1 reduziert die epithelial-mesenchymale Transition bei tracheobronchialer Stenose
Die tracheobronchiale Stenose ist eine seltene, jedoch klinisch relevante Erkrankung, die durch Atemwegfibrose gekennzeichnet ist und mit erheblicher Morbidität und Mortalität einhergehen kann. Das Epithel bildet als erste Barriere gegen exogene Umwelteinflüsse eine entscheidende Komponente zur Aufrechterhaltung der Atemwegsintegrität. Bei Schädigung durchlaufen Epithelzellen die epithelial-mesenchymale Transition (EMT), einen Prozess, der den Verlust von Zell-Zell-Verbindungen, die Auflösung der apikobasalen Polarität, die Reorganisation des Zytoskeletts und erhöhte Zellmotilität umfasst. Obwohl die EMT für die epitheliale Reparatur essenziell ist, steht ihre dysregulierte Reaktivierung im Zusammenhang mit Gewebefibrose, die durch den Verlust epithelialer Marker wie E-Cadherin und die Überexpression mesenchymaler Marker wie N-Cadherin, Vimentin und Alpha-Glattmuskelaktin (α-SMA) gekennzeichnet ist.
Der transformierende Wachstumsfaktor-beta 1 (TGF-β1) ist ein zentraler Mediator der Gewebenarbung, hauptsächlich über die Aktivierung des Smad-Signalwegs. Insbesondere die Hochregulation von Smad3 fördert die Zellmigration und EMT. Die Rolle des Slit-Robo-Signalwegs, insbesondere des Roundabout-Rezeptors 1 (Robo1), im pathologischen Reparaturprozess der tracheobronchialen Stenose ist bisher unerforscht. Diese Studie untersucht die Beteiligung von Robo1 an der EMT und sein Potenzial als therapeutische Zielstruktur.
Zur Analyse von Robo1 wurden tracheale Granulationsgewebe von Patienten nach interventioneller Bronchoskopie sowie gesundes Trachealgewebe von Larynxkarzinom-Patienten entnommen. Zusätzlich wurde ein Rattenmodell der Trachealfibrose etabliert (Sprague-Dawley-Ratten, unterteilt in Kontroll- und Fibrosegruppen). Die Studie erfolgte gemäß der Deklaration von Helsinki und wurde durch die Ethikkommission der First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University genehmigt. Bronchiale BEAS-2B-Epithelzellen wurden mit TGF-β1, Slit2 und dem TGF-β-Inhibitor SB431542 behandelt. Mittels lentiviraler shRNA wurde Robo1 in BEAS-2B-Zellen silenziert, um stabile shRNA-Robo1- und Negativkontrollzelllinien (shRNA-NC) zu generieren.
Histologische Färbungen (Hämotoxylin-Eosin, Masson-Trichrom) an Rattengeweben zeigten in der Fibrosegruppe Entzündungszellinfiltration, erweiterte Lamina propria, Epitheldefekte und erhöhte Kollagenablagerung. Die immunhistochemische Färbung (IHC) wies eine verstärkte Robo1-Expression im Granulationsgewebe nach. Quantitative PCR und Western Blot bestätigten eine signifikant erhöhte Robo1-mRNA- und Proteinexpression in humanen Granulationsgeweben sowie im Rattenmodell. TGF-β1-Stimulation induzierte in BEAS-2B-Zellen eine dosisabhängige Robo1-Hochregulation und gesteigerte Proliferation (maximal bei 10 ng/mL).
Das Silencing von Robo1 supprimierte die TGF-β1-induzierte Expression mesenchymaler Marker (N-Cadherin, Vimentin, α-SMA) und stabilisierte E-Cadherin. Immunfluoreszenzanalysen bestätigten diese Effekte. Die Hemmung von Robo1 reduzierte zudem die Phosphorylierung von Smad3 (p-Smad3), ohne die Gesamt-Smad3-Expression zu beeinflussen, was auf eine Unterbrechung des kanonischen TGF-β1-Smad3-Signalwegs hinweist. Slit2-Behandlung verstärkte die Robo1-Expression in TGF-β1-stimulierten Zellen, während SB431542 diese unterdrückte. Slit2 antagonisierte partiell die SB431542-induzierte Hemmung der EMT-Marker und p-Smad3-Expression. Non-kanonische PI3K/AKT-Signalwege wurden durch SB431542 gehemmt, mit leichter Reversion durch Slit2.
Die Studie identifiziert Robo1 als Schlüsselmediator der TGF-β1-induzierten EMT bei tracheobronchialer Stenose. Interessanterweise zeigt Slit2 in Fibroblasten gegensätzliche Effekte, was auf zelltypspezifische Regulation hinweist, möglicherweise bedingt durch Unterschiede in Rho-GTPasen oder Slit/Robo-Effektorproteinen (z. B. srGAPs, MYO9B). Weitere Studien sind erforderlich, um die Rolle von Slit2-Robo1 in srGAPs und MYO9B während der EMT zu klären.
Zusammenfassend demonstriert diese Arbeit, dass die Hemmung von Robo1 die EMT durch Suppression des p-Smad3-Signalwegs abschwächt. Diese Erkenntnisse unterstreichen das therapeutische Potenzial von Robo1-Inhibitoren zur Behandlung der tracheobronchialen Stenose und anderer fibrotischer Erkrankungen.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000002528