Mikrobielle und epidemiologische Faktoren bei der Früherkennung von Plattenepithelkarzinomen der Speiseröhre und präkanzerösen Läsionen
Speiseröhrenkrebs (EC) ist ein bedeutendes globales Gesundheitsproblem und rangiert weltweit an neunter Stelle bei der Krebsmorbidität und an fünfter Stelle bei der Mortalität. Unter seinen Subtypen ist das Plattenepithelkarzinom der Speiseröhre (ESCC) die vorherrschende Form in China. Die Früherkennung und Diagnose sind entscheidend, um die Morbidität und Mortalität im Zusammenhang mit ESCC zu reduzieren. Während sich die Endoskopie-Screening in Hochrisikopopulationen als wirksam erwiesen hat, bleibt die breite Anwendung in größeren, natürlichen Populationen eine Herausforderung. Mit den Fortschritten in der Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie hat sich die Erforschung der Mikrobiota als vielversprechendes Feld für die Identifizierung neuer Biomarker für das primäre Screening von ESCC herausgestellt. Diese Studie untersucht die mikrobiellen und epidemiologischen Faktoren, die mit dem Fortschreiten von ESCC verbunden sind, und konzentriert sich dabei auf gepaarte Speiseröhrenbiopsie- und Abstrichproben, um Risikostratifizierungsmodelle für Hochrisikopopulationen zu entwickeln.
Die Studie wurde im Rahmen des nationalen EC-Screening-Projekts in China durchgeführt. Es wurden 234 Teilnehmer aus Linzhou, Provinz Henan, eingeschlossen, darunter 70 gesunde Personen, 69 mit Ösophagitis, 70 mit niedriggradiger intraepithelialer Neoplasie (LGIN), 18 mit hochgradiger intraepithelialer Neoplasie (HGIN) und sieben mit ESCC. Geschulte epidemiologische Untersucher sammelten Basisdaten zu Ernährungsgewohnheiten, Lebensstil und Mundgesundheit. Alle Teilnehmer gaben ihre informierte Zustimmung, und die Studie wurde von der Ethikkommission des Krebskrankenhauses der Chinesischen Akademie der Medizinischen Wissenschaften genehmigt.
Gepaarte Speiseröhrenabstrich- und Biopsieproben wurden von jedem Teilnehmer entnommen. Abstrichproben wurden mit einer sterilen Bürste gewonnen, wobei fünf Schleifen an der Läsionsstelle oder in der Mitte der Speiseröhre entnommen wurden, wenn keine Läsion vorhanden war. Der Bürstenkopf wurde in ein steriles Röhrchen mit zellkonservierender Flüssigkeit geschnitten. Biopsieproben wurden makroskopisch von der Bürstenstelle entnommen und in sterile Röhrchen gelegt. Alle Proben wurden unmittelbar nach der Entnahme bei −80℃ gelagert und auf Trockeneis ins Labor transportiert.
Die bakterielle DNA wurde mit dem PowerSoil DNA Isolation Kit extrahiert und in Tris-EDTA-Pufferlösung bei −80℃ gelagert. Die V4-Region des 16S ribosomalen RNA (rRNA)-Gens wurde mit universellen bakteriellen Primern amplifiziert. PCR-Mischungen enthielten Vorwärts- und Rückwärtsprimer, Template-DNA, Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs), EasyPfu-Puffer, EasyPfu-DNA-Polymerase und doppelt destilliertes Wasser. Der PCR-Thermocycler umfasste Denaturierung, Annealing und Verlängerungsschritte. Amplikone wurden mit einem Qubit Doppelstrang-DNA (dsDNA) HS Assay Kit quantifiziert, und Bibliotheken wurden auf der Illumina MiniSeq-Plattform sequenziert. Rohsequenzen wurden für die Qualitätskontrolle und die Konstruktion von Merkmaltabellen mit dem DADA2-Algorithmus verarbeitet. Die taxonomische Zuordnung wurde mit einem vortrainierten Naive Bayes-Klassifikator über das q2-feature-classifier-Plugin bestimmt. Um eine Verzerrung durch die Probenentnahmetiefe zu vermeiden, wurden 1000 Reads zufällig aus jeder Probe ausgewählt, um die relative Häufigkeit der Taxa zu berechnen.
Die Studie identifizierte Indikatorgattungen, die mit dem Fortschreiten von ESCC assoziiert sind, basierend auf statistischen Unterschieden zwischen oder innerhalb der Gruppen Normal, Ösophagitis, LGIN, HGIN und ESCC. Vier Detektionsanforderungen wurden berücksichtigt: (A) Unterscheidung zwischen Normal, Ösophagitis, LGIN, HGIN und ESCC; (B) Unterscheidung zwischen Normal, Ösophagitis, LGIN und HGIN und darüber; (C) Unterscheidung zwischen Normal/Ösophagitis, LGIN und HGIN und darüber; und (D) Unterscheidung zwischen Normal/Ösophagitis und LGIN und darüber.
Statistische Analysen umfassten Chi-Quadrat-Tests, Fisher’s exakte Tests, Wilcoxon-Tests und Kruskal-Wallis-Tests. Mehrfachtests mit Bonferroni-Korrektur wurden durchgeführt. Risikostratifizierungsmodelle wurden mit multinomialer logistischer Regression entwickelt, und Receiver-Operator-Characteristic (ROC)-Kurven mit Fläche unter der Kurve (AUC) wurden erstellt. Zehnfache Kreuzvalidierung wurde für die interne Validierung verwendet, und der normalisierte mittlere quadratische Fehler (NMSE) wurde berechnet.
Signifikante Unterschiede wurden in Alter, Bildungsniveau, Mundgesundheit (Zahnfleischbluten) und Ernährungsgewohnheiten (Trinkwasser, Fleisch, frittierte Lebensmittel und Zwiebeln, Ingwer oder Knoblauch) unter den Teilnehmergruppen beobachtet. Die Alpha-Diversität der Speiseröhrenmikrobiota wurde durch Bildungsniveau, Anzahl der krebskranken Verwandten, Zahnverlust, Zahnfleischbluten, Trinkwasser, Gemüse, scharfes Essen und salzig schmeckende Lebensmittel beeinflusst.
In Biopsieproben wurden 37 Indikatorgattungen identifiziert, die mit dem Fortschreiten von ESCC assoziiert sind. Fusobacterium und Bergeyella zeigten eine signifikant höhere durchschnittliche relative Häufigkeit (ARA%) in der ESCC-Gruppe im Vergleich zur Normalgruppe. Neisseria und Oribacterium waren signifikant unterschiedlich zwischen den präkanzerösen Gruppen (LGIN und HGIN) und der Normalgruppe. Sphingomonas war die einzige Gattung mit signifikanten Unterschieden zwischen der Normalgruppe und den anderen Gruppen und unter den fünf Gruppen. In Abstrichproben zeigten 16 Indikatorgattungen einen ansteigenden Trend von Normal, Ösophagitis, LGIN, HGIN zu ESCC. Capnocytophaga, Aggregatibacter, Bergeyella, Streptococcus und Megasphaera waren statistisch unterschiedlich zwischen der Normalgruppe und der ESCC-Gruppe. Fretibacterium, Filifactor und Solobacterium waren bemerkenswert zwischen der Normalgruppe und den Gruppen LGIN und darüber. Bergeyella zeigte eine statistisch höhere ARA% in der ESCC-Gruppe basierend auf beiden Abstrich- und Biopsieproben. Ralstonia war in der Normalgruppe dominant.
Vierzehn identische Indikatorgattungen wurden zwischen Biopsie- und Abstrichproben beobachtet. Haemophilus, Neisseria, Fusobacterium, Aggregatibacter, Bergeyella und Alysiella nahmen von Normal, Ösophagitis, LGIN, HGIN zu ESCC zu. Streptococcus, Actinomyces, Rikenellaceae RC9-Gruppe, Oribacterium, Filifactor und Novosphingobium nahmen von Normal, Ösophagitis, LGIN, HGIN zu ESCC ab. Neisseria, Rikenellaceae RC9-Gruppe, Oribacterium, Novosphingobium und Alysiella zeigten signifikante Unterschiede zwischen Biopsie- und Abstrichproben in mindestens einer Teilnehmergruppe.
Risikostratifizierungsmodelle wurden mit den Gruppen Normal, Ösophagitis, LGIN, HGIN und ESCC als abhängige Variablen entwickelt. Die Genauigkeit des Modells, das sieben signifikante epidemiologische Faktoren enthielt, betrug 54,26%, höher als das Modell, das acht signifikante epidemiologische Faktoren im Zusammenhang mit der Alpha-Diversität enthielt (37,23%). Acht Indikatorgattungen wurden in das Risikostratifizierungsmodell der fünf Gruppen aufgenommen, mit einer Genauigkeit von 41,49%. Die Kombination jeder Indikatorgattung mit sieben signifikanten epidemiologischen Faktoren ergab Genauigkeiten zwischen 54,26% und 60,64%.
Flexible Kombinationen der acht Indikatorgattungen und sieben signifikanten epidemiologischen Faktoren wurden verwendet, um Risikostratifizierungsmodelle für jede Detektionsanforderung zu entwickeln. Die höchsten Genauigkeiten waren 68,09% (Modell_1-Zahnverlust hinzufügen, AUC = 0,87), 68,09% (Modell_6-Zahnverlust hinzufügen, AUC = 0,84), 73,40% (Modell_7-Zahnverlust hinzufügen, AUC = 0,88) und 84,04% (Modell_12-Zahnverlust hinzufügen, AUC = 0,90). Zehnfache Kreuzvalidierung ergab NMSE-Werte von 0,77, 0,89, 0,83 und 0,92 für die jeweiligen Modelle.
Frühere Studien haben die Assoziation verschiedener Gattungen mit ESCC und die Rolle einer schlechten Mundgesundheit bei der Mikrobiota und dem Fortschreiten von ESCC hervorgehoben. Zahnverlust und Parodontitis sind quantitative Faktoren, die mit einer schlechten Mundgesundheit verbunden sind. Diese Studie simulierte verschiedene Detektionsanforderungen für das primäre ESCC-Screening, wobei „Gruppe A“ als das ideale Modell angesehen wurde, trotz Einschränkungen aufgrund unausgewogener Stichprobengrößen. „Gruppe D“ war rational für die Nachsorge und Behandlung von Personen mit LGIN oder HGIN und darüber. „Gruppe B“ und „Gruppe C“ waren Kompromissmethoden, um die Kosten des Screenings, das medizinische Personal und die Ausrüstungsbeschränkungen zu berücksichtigen. Orale Proben wie Zahnbelag und Speichel könnten bevorzugte Alternativen für die Früherkennung von ESCC sein, aber weitere Studien mit größeren Stichprobengrößen und mehreren Zentren sind erforderlich.
Diese explorative Studie hat Einschränkungen, darunter ihr natürliches populationsbasiertes Design, ähnliche Lebensstile unter den Teilnehmern aus demselben Landkreis und die Unfähigkeit, orale und Speiseröhrenproben von denselben Teilnehmern zu validieren, ohne orale Proben zu sammeln.
Zusammenfassend zeigt die Studie die Machbarkeit der Kombination mikrobieller und epidemiologischer Faktoren, um ESCC und präkanzeröse Läsionen von Normal und Ösophagitis zu unterscheiden. Während die Entnahme von Speiseröhrenproben eine Herausforderung darstellt, bieten orale Proben eine zugänglichere Alternative. Weitere Forschung ist erforderlich, um die Ergebnisse für das primäre Screening von ESCC und präkanzerösen Läsionen mit mikrobiellen Biomarkern zu optimieren und zu verbessern.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000002275