Nachweis von SARS-CoV-2-kodierten kleinen RNAs und deren Beitrag zur infektionsassoziierten Lungenentzündung
SARS-CoV-2, der Erreger von COVID-19, hat sich aufgrund seiner Fähigkeit, schwere respiratorische Komplikationen und systemische Entzündungen auszulösen, zu einer globalen Gesundheitsbedrohung entwickelt. Obwohl das Virus eine Sequenzidentität von ~79,2 % mit SARS-CoV-1 aufweist, sind seine Pathogenitätsmechanismen, insbesondere diejenigen, die die Lungenentzündung antreiben, noch nicht vollständig verstanden. Aktuelle Studien zu SARS-CoV-1 haben die Produktion von kleinen viralen RNAs (svRNAs) aufgezeigt, die die Lungenschädigung verschlimmern. Aufbauend auf dieser Entdeckung untersucht die vorliegende Studie, ob SARS-CoV-2 ebenfalls svRNAs kodiert und bewertet deren Rolle bei der Modulation der Wirtsentzündungsreaktionen während der Infektion.
Identifizierung und Nachweis von SARS-CoV-2-kodierten svRNAs
Die Studie verglich zunächst die zehn am häufigsten vorkommenden SARS-CoV-1-abgeleiteten svRNAs mit dem SARS-CoV-2-Genom, um sechs potenzielle svRNAs zu identifizieren, die von SARS-CoV-2 kodiert werden könnten (Supplementary Table 1). Die experimentelle Validierung erfolgte anhand klinischer Proben, darunter fünf SARS-CoV-2-positive Nasopharyngealsekrete, zwei formalinfixierte und paraffineingebettete (FFPE) Lungengewebeproben von COVID-19-Patienten, die sich einer Lungentransplantation unterzogen hatten, sowie in vitro-Modelle mit der humanen bronchialen Epithelzelllinie 16HBE. Die Poly(A)-Polymerase-Tailing-Methode in Kombination mit Reverse-Transcription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) und Pyrosequenzierung bestätigte die Existenz von zwei svRNAs – svRNA-5p und svRNA-3p – in infizierten klinischen Proben und transfizierten Zellen (Abbildung 1A, B).
Die Sekundärstrukturvorhersage mithilfe des RNAfold-Webservers deutete darauf hin, dass diese beiden svRNAs von derselben Vorläufer-RNA stammen und eine 66-Basenpaar-Haarnadelstruktur bilden (Abbildung 1C, Supplementary Figure 2). Die Sequenz dieses Vorläufers, aufgeführt in Supplementary Table 4, wies auf einen potenziell nicht-kanonischen Biogenese-Pfad hin, da die svRNAs nicht von RNase III, Zelltyp oder Wirtsspezies abhängig waren, sondern mit dem viralen Replikationsniveau korrelierten. Diese Beobachtung stimmt mit früheren Erkenntnissen zu SARS-CoV-1 überein, bei denen gezeigt wurde, dass svRNAs den Wirts-RNA-Interferenzmechanismen entgehen.
Transkriptomische Profilierung der COVID-19-assoziierten Lungenentzündung
Um das Entzündungsprofil von SARS-CoV-2-infizierten Lungen zu charakterisieren, wurden neun öffentlich verfügbare RNA-Sequenzierungsdatensätze von COVID-19-Patienten (Supplementary Table 5) analysiert. Fünfunddreißig Gene wurden als signifikant hochreguliert in COVID-19-Patienten identifiziert und bildeten ein charakteristisches Expressionsprofil (Supplementary Table 6). Gen-Ontologie (GO)- und Kyoto-Enzyklopädie-der-Gene-und-Genome (KEGG)-Anreicherungsanalysen hoben Signalwege hervor, die mit Typ-I-Interferon (IFN)-Signalgebung, Chemokinaktivität und Immunantwortaktivierung assoziiert waren (Abbildung 1E).
Weitere Validierungen mittels RT-qPCR an FFPE-Lungengeweben von COVID-19-Patienten und nicht-infizierten Kontrollen bestätigten die Hochregulierung von 16 Genen aus dem 35-Gen-Profil sowie von 8 Zytokinsturm-assoziierten Genen, darunter CXCL5, CXCL9, CXCL11, IFNG, IFNL1 und IL1A (Abbildung 1F, Supplementary Tables 8 und 9). Anreicherungsanalysen bestätigten erneut die Bedeutung der IFN-vermittelten Immunität und der Chemokinsignalgebung bei der Entzündungsentstehung (Abbildung 1G). Diese Ergebnisse unterstreichen die Hyperaktivierung angeborener Immunwege in COVID-19-Lungen, was mit dem Zytokinsturm in schweren Fällen übereinstimmt.
Pro-inflammatorische Effekte des SARS-CoV-2-svRNA-Vorläufers
Um die funktionelle Rolle der identifizierten svRNAs zu bewerten, wurden 16HBE-Zellen mit synthetischen Vorläufern von svRNA-5p, svRNA-3p oder einer Kontroll-RNA transfiziert. Zellen, die mit dem svRNA-Vorläufer transfiziert wurden, zeigten die ausgeprägteste Entzündungsreaktion, charakterisiert durch eine signifikante Hochregulierung von CXCL8, CXCL11, IFNA1, IFNB1, IFNG und IFNL1 (Abbildung 1H). Bemerkenswerterweise induzierten Transfektionen mit den reifen svRNAs allein keine ähnlichen Effekte, was darauf hindeutet, dass die Entzündungsreaktion vom Vorläufermolekül und nicht von den prozessierten svRNAs abhängt.
GO- und KEGG-Analysen der differentiell exprimierten Gene in transfizierten Zellen implizierten erneut Typ-I-IFN-Signalwege und Chemokin-vermittelte Signalgebung als zentrale Mechanismen (Abbildung 1I). Zeit- und dosisabhängige Experimente zeigten, dass die pro-inflammatorischen Effekte des svRNA-Vorläufers nicht dosisabhängig waren, sich jedoch im Laufe der Zeit verstärkten. 96 Stunden nach der Transfektion wurde eine anhaltende Hochregulierung von CXCL8, CXCL11 und IFNB1 beobachtet, begleitet von sechs Genen aus dem 35-Gen-COVID-19-Profil: IFI27, EIF2AK2, LY6E, DDX58, BTN3A1 und SERPING1 (Abbildung 1J, K, Supplementary Figure 3). Diese Ergebnisse legen nahe, dass der svRNA-Vorläufer die Entzündung durch eine Verstärkung der IFN- und Chemokinantworten aufrechterhält, was möglicherweise zur anhaltenden Immunaktivierung bei schweren COVID-19-Fällen beiträgt.
Implikationen für die SARS-CoV-2-Pathogenese und Therapeutika
Die Studie hebt zwei zentrale Erkenntnisse hervor:
- SARS-CoV-2 kodiert funktionelle svRNAs: Der Nachweis von svRNA-5p und svRNA-3p in klinischen Proben und Zellmodellen bestätigt, dass SARS-CoV-2, ähnlich wie SARS-CoV-1, svRNAs produziert. Diese Moleküle stammen wahrscheinlich von einem gemeinsamen Vorläufer und befinden sich in der Nähe der Enden des viralen Genoms – ein Muster, das auch bei anderen RNA-Viren beobachtet wird.
- Der svRNA-Vorläufer treibt die Entzündung an: Das Vorläufermolekül, nicht die reifen svRNAs, aktiviert Signalwege, die für die IFN- und Chemokinantworten entscheidend sind. Dieser Mechanismus ähnelt dem von SARS-CoV-1, bei dem die Hemmung von svRNA-N die Lungenschädigung reduzierte, was auf eine konservierte Strategie unter Coronaviren hinweist, die Wirtsimmunität zu manipulieren.
Die Biogenese der SARS-CoV-2-svRNAs bleibt unklar, scheint jedoch unabhängig von kanonischen RNAi-Signalwegen zu sein. Weitere Forschung zu ihren Produktionsmechanismen könnte therapeutische Angriffspunkte aufdecken. Beispielsweise könnte die Unterbrechung der Vorläuferstruktur oder die Hemmung seiner Prozessierung die Entzündung abschwächen, ohne die virale Replikation direkt zu beeinflussen – eine Strategie, die bestehende antivirale Therapien ergänzen könnte.
Schlussfolgerung
Diese Studie liefert den ersten Nachweis von SARS-CoV-2-kodierten svRNAs und deren Beitrag zur infektionsassoziierten Lungenentzündung. Die Rolle des svRNA-Vorläufers bei der Aktivierung von CXCL8, CXCL11 und Typ-I-IFN-Signalwegen bietet neue Einblicke in die COVID-19-Pathogenese. Diese Erkenntnisse ebnen den Weg für neuartige Therapeutika, die darauf abzielen, übermäßige Immunantworten zu mildern und möglicherweise die Morbidität in schweren Fällen zu reduzieren.
doi:10.1097/CM9.0000000000002059