Ein kostengünstiger und hocheffizienter 10-in-1-Test zum PCR-basierten Screening von SARS-CoV-2-Infektionen in Gebieten mit geringem Risiko
Die globale Auswirkung des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) war tiefgreifend, mit weltweit Millionen von Infektionen und Todesfällen. Bis zum 9. August 2020 hatte das Virus über 19 Millionen Menschen infiziert und mehr als 720.000 Todesopfer gefordert. Um die Ausbreitung einzudämmen, war die zeitnahe Identifizierung Infizierter durch nukleinsäurebasierte Screenings entscheidend, insbesondere in Hochrisikogebieten wie Wuhan, Peking und Xinjiang. Großflächige Screenings stellen jedoch erhebliche Herausforderungen dar, darunter hohe Kosten, Ressourcenverbrauch und begrenzte Testkapazitäten. Zur Lösung dieser Probleme wurde ein neuartiger 10-in-1-Test entwickelt, der eine kostengünstige und effiziente Methode für SARS-CoV-2-Screenings in Niedrigrisikogebieten bietet.
Herausforderungen bei großflächigen Screenings
Großangelegte nukleinsäurebasierte Screenings sind unerlässlich, um Infizierte zu identifizieren und Quarantänemaßnahmen einzuleiten. Dennoch weist dieser Ansatz mehrere Einschränkungen auf. Der Verbrauch von Geräten und Reagenzien für Probenentnahme und Detektion ist erheblich, was die Kosten erhöht. Zudem stoßen Testkapazitäten medizinischer Einrichtungen bei steigenden Probenzahlen schnell an ihre Grenzen. Pooling-Strategien, wie das Mischen von Probenpufferlösungen vor der Nukleinsäureextraktion, wurden vorgeschlagen, führen jedoch zur Verdünnung der Proben und reduzieren die Nachweisempfindlichkeit. Bisher fehlten Studien, die den Kompromiss zwischen Effizienzsteigerung und Sensitivitätsverlust systematisch adressieren.
Entwicklung des 10-in-1-Tests
Um diese Herausforderungen zu bewältigen, wurde ein innovativer 10-in-1-Test konzipiert. Hierbei werden zehn Rachenabstriche von zehn Personen in einem speziell angefertigten Virus-Sammelröhrchen (CMT) zusammengeführt. Das CMT wurde so optimiert, dass zehn Abstriche problemlos aufgenommen werden können, ohne die Handhabung zu erschweren. Das Röhrchen hat einen Außendurchmesser von 14,8 ± 0,2 mm, eine Höhe von 100,5 ± 0,4 mm und enthält 6 mL einer Konservierungslösung mit Guanidiniumsalz – doppelt so viel wie in Einzelprobenröhrchen (IAT) mit 3 mL. Die verwendeten Rachenabstriche bestehen aus Polypropylen-Flockenwatte mit einer Kopflänge von 2 cm, einem Durchmesser von 3–5 mm und einer Bruchstelle 3 cm vom Kopf entfernt.
Evaluierung des 10-in-1-Tests
Das Studienprotokoll wurde von den Ethikkommissionen des Shengjing-Krankenhauses der China Medical University und des Dalian Sixth People’s Hospital genehmigt. Daten eines Screenings in Dalian mit 7 Millionen Teilnehmenden dienten zur Evaluierung. Insgesamt wurden 2,15 Millionen Personen eingeschlossen, darunter 82.000 zur Bewertung der Röhrchenhandhabung und 640 Personen zur Methodenkonsistenz. Unter den 640 Personen befanden sich 64 COVID-19-Fälle und 576 virusnegative Freiwillige.
Für den 10-in-1-Test wurden Rachenabstriche von 19 SARS-CoV-2-positiven Patienten und asymptomatischen Freiwilligen am ersten Tag nach der Krankenhausaufnahme mittels IAT gesammelt. Abstriche von 171 negativen Freiwilligen wurden in CMT-Röhrchen (neun Abstriche pro Röhrchen) gelagert. Jeweils 200 µL der Konservierungslösung aus IAT und CMT wurden gemischt und einer RNA-Extraktion unterzogen. Mittels Echtzeit-Reverse-Transkriptions-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) wurden die viralen Gene ORF1ab und NP amplifiziert. Die RT-PCR-Kits (Guangzhou Da’an Gene Biotechnology Co., Ltd. und Wuhan Mingde Biotechnology Co., Ltd.) wiesen eine Nachweisgrenze von 500 Kopien/mL auf.
Die Cycle-Threshold-Werte (Ct-Werte) für ORF1ab und NP in IAT-Proben betrugen 28,89 ± 5,21 bzw. 29,02 ± 5,74. In der 10-in-1-Simulation (positive Proben gemischt mit neun negativen) lagen die Ct-Werte bei 30,00 ± 5,07 bzw. 30,03 ± 5,56. Während alle 19 IAT-Proben positiv waren, ergab die Simulation 18 positive und ein unsicheres Ergebnis (nur ORF1ab positiv). Die positive Übereinstimmungsrate zwischen IAT und 10-in-1-Simulation betrug 94,7 %.
Leistung im realen 10-in-1-Test
Zur Validierung unter Realbedingungen wurden Proben von 405 Freiwilligen und 45 COVID-19-Patienten gesammelt. Jeder Freiwillige lieferte zwei Abstriche: einen für IAT und einen für CMT (mit neun verschiedenen Abstrichen). Die Ct-Werte für ORF1ab und NP aus IAT- und CMT-Proben waren konsistent, mit Kappa-Werten von 0,863 (95 %-Konfidenzintervall [KI]: 0,7552–0,9708) und 0,973 (95 %-KI: 0,92008–1,02592) für die Da’an- bzw. Mingde-Kits. Der Kappa-Wert für 450 IAT-Proben, die mit beiden Kits getestet wurden, betrug 0,856.
Großflächige Screenings in Niedrigrisikogebieten
Der 10-in-1-Test wurde in Dalian, Qingdao und Shenyang eingesetzt, wobei 2,15 Millionen, 11 Millionen bzw. 7,7 Millionen Personen gescreent wurden. In Dalian und Qingdao wurden keine positiven Fälle identifiziert, und in Shenyang wurde ein asymptomatischer Patient entdeckt. Diese Ergebnisse unterstreichen die Zuverlässigkeit des Tests für COVID-19-Screenings in Niedrigrisikogebieten.
Designüberlegungen und zukünftige Richtungen
Die Entwicklung des 10-in-1-Tests adressierte drei Kernprobleme: (1) Die CMT-Röhrchen ermöglichen eine praktikable Handhabung von zehn Abstrichen. (2) Die erhöhte Konservierungsmittelmenge gewährleistet eine ausreichende Elution bei nur geringer Ct-Wert-Erhöhung (+1). (3) Obwohl initial Proben behandelter Patienten verwendet wurden, deuten hohe Viruslasten bei Neuinfizierten auf eine noch bessere Performance in Primärscreenings hin.
Schlussfolgerung
Der 10-in-1-Test bietet eine kosteneffiziente und zuverlässige Methode für großflächige SARS-CoV-2-Screenings in Niedrigrisikogebieten. Durch Optimierung der Pooling-Technik und Reduktion von Ressourcenverbrauch ermöglicht er eine schnelle Identifizierung Infizierter. Zukünftige Forschung sollte weitere Pooling-Optimierungen und die Eignung für noch größere Bevölkerungsgruppen untersuchen.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000001627