Astaxanthin fördert M2-Makrophagen und mildert die kardiale Remodellierung nach Myokardinfarkt durch Unterdrückung der Entzündung bei Ratten
Einleitung
Die koronare Herzkrankheit (KHK) ist die häufigste Ursache für akuten Myokardinfarkt (AMI) und Herzinsuffizienz (HF) weltweit. Das Fortschreiten der HF ist eng mit der kardialen Remodellierung verbunden, einem Prozess, der molekulare, zelluläre und interstitielle Ereignisse umfasst, die zu klinisch relevanten Veränderungen in Form, Größe und Masse des Herzens nach einer kardialen Verletzung führen. Nach einem Myokardinfarkt (MI) reduziert die kardiale Remodellierung den Ventrikelwanddruck und erhält vorübergehend die Pumpfunktion des Herzens. Letztendlich entwickelt sie sich jedoch zu einer destruktiven maladaptiven Veränderung, die zu HF und sogar zum Tod führt. Daher müssen Kliniker wirksame therapeutische Ziele identifizieren, um eine übermäßige Myokardfibrose bei der Behandlung der ventrikulären Remodellierung nach AMI zu verhindern.
Astaxanthin (ASX) ist ein Xanthophyll-Carotinoid, das zwei oxygenierte Gruppen an jeder Ringstruktur enthält, die für die verstärkte antioxidative Aktivität verantwortlich sind. ASX ist ein stärkerer Peroxidradikalfänger als Beta-Carotin, Alpha-Tocopherol, Alpha-Carotin, Lutein und Lycopin. Studien haben berichtet, dass ASX die renale Fibrose reduzieren, die Apoptose von Nierenzellen verbessern, Krebs bekämpfen und das Potenzial von Stammzellen erhöhen kann. Es kann auch die Vernarbung der Stimmbänder in den frühen Stadien der Wundheilung verhindern, indem es die oxidative Stressreaktion reguliert. Daraus folgt, dass ASX eine starke schützende Wirkung auf das Myokard hat. Die vorliegende Studie zielte darauf ab, zu bestimmen, ob ASX die kardiale Remodellierung nach AMI verbessert.
Methoden
Alle experimentellen Protokolle, die Ratten betrafen, wurden zwischen April 2018 und September 2018 durchgeführt und sowohl vom Ausschuss für Tierpflege und -nutzung als auch vom Ethikausschuss für Tierforschung unserer Institution genehmigt. Saubere männliche Sprague-Dawley-Ratten im Alter von 6 bis 8 Wochen und einem Gewicht von 220 bis 250 g wurden in einem sauberen Raum bei konstanter Temperatur (22–25°C) unter einem 12:12 h Hell-Dunkel-Zyklus gehalten. Die Ratten wurden von der Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd. gekauft und erhielten ad libitum Futter und Wasser. Die vorliegende Studie wurde gemäß den Empfehlungen des Leitfadens für den Nationalen Wissenschaftsrat von China durchgeführt.
Ergebnisse
AMI führte zu einer signifikanten Verschlechterung der Herzfunktion und erhöhte die Entzündungsfaktoren. Nach der Ligatur der LAD-Koronararterie verschlechterte sich die Funktion der Herzen der Ratten sowohl in der AMI- als auch in der ASX-Gruppe, und es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Gruppen beobachtet. Dies zeigte, dass wir das AMI-Modell erfolgreich konstruiert hatten, um die ASX-Gruppe mit der Sham-Gruppe zu vergleichen. Darüber hinaus war der Spiegel der Entzündungsfaktoren vor der ASX-Verabreichung erhöht.
ASX hemmte signifikant die Expression von pro-inflammatorischen Zytokinen und förderte die Expression von anti-inflammatorischen Zytokinen am 7. Tag nach dem Myokardinfarkt. Die TNF-α- und IL-1β-Spiegel waren in der ASX-Gruppe signifikant niedriger als in der AMI-Gruppe am 7. Tag nach AMI, während der Spiegel des anti-inflammatorischen Faktors IL-10 in der ASX-Gruppe signifikant höher war als in der AMI-Gruppe.
Die ASX-Behandlung verbesserte die Herzfunktion. Die echokardiographischen Parameter waren in der AMI-Gruppe signifikant schlechter. Umgekehrt zeigte die ASX-Gruppe, dass die Verschlechterung der Herzfunktion reduziert war, und die Ergebnisse waren im Vergleich zur AMI-Gruppe statistisch signifikant.
ASX reduzierte die Myokardinfarktgröße nach AMI. Nach 28 Tagen AMI waren die Herzproben in der AMI-Gruppe visuell dilatiert, und die Myokardtransmuralnekrose im Infarktbereich war blass und dünn. Die Infarktgröße in der ASX-Gruppe war jedoch kleiner.
ASX reduzierte die Kollagenproduktion nach AMI. Am 28. Tag nach AMI wurden die Kollagenfasern blau und das Myokard rot gefärbt. In der Sham-Gruppe gab es keine offensichtliche Fibroplasie, während in der AMI-Gruppe eine Myokardhyperplasie vorlag und die Kardiomyozyten ungeordnet waren. In der ASX-Gruppe war die kardiale Fibrose signifikant geringer als in der AMI-Gruppe, und die Kollagenfasern waren im Wesentlichen ausgerichtet.
Der Anteil der M2-Makrophagen war in der ASX-Gruppe höher als in der AMI-Gruppe am 7. Tag nach dem Myokardinfarkt. Wir verwendeten IF-Färbung und FC, um Makrophagen quantitativ zu analysieren. In den IF-gefärbten Paraffinschnitten waren die Makrophagenkerne blau und die Oberflächenmarker rot gefärbt. Die integrierte optische Dichte war in der ASX-Gruppe höher als in der AMI-Gruppe, was darauf hindeutet, dass die Infiltration von M2-Makrophagen in die Grenzzone in der ASX-Gruppe größer war als in der AMI-Gruppe am 7. Tag nach AMI.
ASX hemmte die Apoptose von Kardiomyozyten in den Grenzzonen. Die apoptotischen Kardiomyozyten waren unter dem Fluoreszenzmikroskop nach TUNEL-Färbung grün gefärbt. In der Sham-Gruppe wurden fast keine grünen Flecken beobachtet, während in der AMI-Gruppe eine große Anzahl beobachtet wurde. Die Apoptose von Kardiomyozyten war in der ASX-Gruppe signifikant reduziert.
ASX reduzierte die Spiegel von myokardfibrosebezogenen Proteinen nach AMI. Wir bewerteten die Spiegel klassischer Proteinmarker, die mit Myokardfibrose nach AMI assoziiert sind, einschließlich Caspase 3, TGF-β1, MMP9 und Kollagen I/III am 28. Tag nach AMI. In der AMI-Gruppe waren die Spiegel dieser Indikatoren höher als in der Sham-Gruppe, und ASX reduzierte die Expression dieser Proteine signifikant.
Diskussion
Die pathologische kardiale Remodellierung umfasst strukturelle und funktionelle Veränderungen des linken Ventrikels als Reaktion auf kardiovaskuläre Schäden oder pathogene Risikofaktoren. Sie ist mit Entzündungen und Myokardfibrose verbunden. Im Allgemeinen gibt es drei verschiedene Phasen nach AMI, nämlich die entzündliche Infiltrationsphase (Stunden bis Tage), die anschließende proliferative Phase (Tage bis Wochen) und die Reifungsphase (mehrere Wochen). Die Entzündungsreaktion auf AMI spielt eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der Infarktgröße und der anschließenden nachteiligen kardialen Remodellierung. Nach früheren Studien ist der 7. Tag nach AMI ein wichtiger Zeitpunkt für den Übergang von einem pro-inflammatorischen Phänotyp zu einem anti-inflammatorischen Phänotyp.
Viele Studien haben bestätigt, dass ASX eine starke organschützende Wirkung hat. In jeweiligen Übersichtsartikeln behaupteten Fassett und Coombes, dass ASX eine starke schützende Wirkung in Maus-, Ratten- und Kaninchen-Myokardischämie-Reperfusionsmodellen hat und dass es die MIS signifikant reduziert, indem es die Entzündung reduziert. Xue et al. zeigten, dass ASX oxidativen Stress durch Aktivierung des Nrf2/HO-1-Signalwegs unterdrückt und somit die durch koronare Mikroembolisation induzierte Kardiomyozytenapoptose verhindert und die kardiale Dysfunktion bei Ratten verbessert. Garrett et al. behandelten Sprague-Dawley-Ratten mit verschiedenen Dosen von ASX (25, 50 und 75 mg·kg-1·Tag-1 für 4 aufeinanderfolgende Tage) vor und entwickelten anschließend ein Myokardischämie-Reperfusionsmodell. Sowohl die hämodynamischen Veränderungen als auch die Infarktbereiche waren nach Myokardischämie in den ASX-behandelten Ratten signifikant kleiner, und die Veränderung war positiv mit der Blutmedikamentenkonzentration korreliert. Sie entwickelten ein Hundemodell des Myokardischämie-Reperfusionsmodells und fanden ähnliche Ergebnisse. Lauver et al. behandelten Kaninchen intravenös mit Dinatriumdisuccinat ASX für 4 aufeinanderfolgende Tage in einer Dosis von 50 mg·kg-1·Tag-1. Am 5. Tag unterzogen sich die Kaninchen 30 min Koronararterienokklusion, gefolgt von einer 3-stündigen Reperfusionsperiode, was zu einer signifikant niedrigeren Komplementaktivierung und Myokardinfarktgröße führte.
Wir ligierten die LAD-Koronararterie der Ratte permanent, um ein AMI-Modell zu entwickeln. Wir identifizierten Veränderungen der Herzfunktion nach AMI mittels Echokardiographie und relativer LW-Ratio. Die Verschlechterung von LVIDd, EDV, EF und %FS sowie die erhöhte relative LW-Ratio sind typische Manifestationen der kardialen Insuffizienz nach AMI. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Herzfunktion bei Ratten nach AMI signifikant schlechter war und dass die ASX-Intervention die Herzfunktion verbesserte und die MIS reduzierte. Diese Befunde stimmten mit den histologischen Veränderungen überein, die mittels H&E-, Masson-Trichrom- und TUNEL-Färbung bewertet wurden.
In früheren Studien haben Forscher mehr Aufmerksamkeit auf die schützende Wirkung von ASX auf Myokardischämie-Reperfusionsverletzungen gerichtet; daher haben die meisten früheren Untersuchungen eine Vorbehandlung oder eine kurzfristige Hochdosisverabreichung verwendet. Die vorliegende Studie konzentrierte sich auf die Beobachtung der Myokardfibrose oder kardialen Remodellierung nach AMI; daher verwendeten wir eine einzelne kleine Dosis und eine lange postinfarktäre Behandlungszeit. Wir verabreichten den Ratten 10 mg/kg ASX täglich für 28 Tage nach AMI, und die Gesamtmenge des Medikaments war ähnlich der in der oben genannten Studie verwendeten.
Makrophagen sind angeborene Immunzellen, die früh nach AMI in die Infarktzone infiltrieren. Sie sind an Entzündung und Reparatur beteiligt. Eine aktuelle Studie zeigte, dass die Herzreparatur verbessert wurde, wenn Makrophagen vom klassisch aktivierten Makrophagen (M1) mit einem pro-inflammatorischen Phänotyp in den alternativ aktivierten Makrophagen (M2) mit einem anti-inflammatorischen Phänotyp umgewandelt wurden. In der proliferativen Phase werden mehr M2-Makrophagen rekrutiert, während mehrere typischerweise pro-inflammatorische Faktoren wie TNF-α und IL-1β weniger sezerniert werden, während IL-10, ein klassischer anti-inflammatorischer Faktor, aus der Infarktzone sezerniert wird, um Schäden zu reduzieren und die Gewebereparatur zu aktivieren. In der vorliegenden Studie detektierten wir Makrophagen in der Grenzzone mittels IF-Färbung und im PB mittels FC. M2-Makrophagen haben viele Oberflächenmarker wie CD11b/CD68, F4/80, CD206, induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase und Arg-1. Wir detektierten das klassische Arg-1 mittels IF-Färbung und CD11b/CD68/Arg-1 mittels FC, um die Zelloberfläche zu analysieren. Der Haupttyp der infiltrierenden Makrophagen in der Grenzzone war der M2 am 7. Tag nach dem Infarkt. Die Anzahl der M2-Makrophagen in der ASX-Gruppe war signifikant höher als in der AMI-Gruppe. Ein weiteres wichtiges Ergebnis, das die Makrophagenpolarisation unterstützte, war die Expression von Entzündungsfaktoren zu verschiedenen Zeitpunkten. M2-Makrophagen sezernieren hauptsächlich anti-inflammatorische Faktoren wie IL-10 und IL-13. Wir maßen TNF-α, IL-1β und IL-10 im PB am 7. Tag nach AMI mittels ELISA. Die Ergebnisse stimmten mit den Veränderungen der Makrophagenpolarisation überein. Die pro-inflammatorischen Faktoren TNF-α und IL-1β stiegen signifikant an, und die ASX-Behandlung kehrte diese Veränderung um. Umgekehrt war die IL-10-Konzentration in der ASX-Gruppe höher als in der AMI-Gruppe. Die Ergebnisse zeigen, dass ASX die Entzündung nach AMI linderte und die Schadensreparatur förderte und dass der Mechanismus dieser schützenden Wirkung mit der ASX-induzierten Makrophagenpolarisation zusammenhängen könnte.
Peng et al. transplantierten humane Nabelschnurblut-Mesenchymale Stammzellen (hUCB-MSCs) über die Schwanzvene in ein Mausmodell von AMI. Die Ergebnisse zeigten, dass die intravenöse Transplantation von hUCB-MSCs die Entzündungsreaktion reduzieren konnte, indem sie die Umwandlung des intrakardialen und extrakardialen Makrophagensubtyps von M1 zu M2 stimulierte. Außerdem konnten sie die Herzfunktion verbessern und das infarktierte Myokard schützen. Heinen et al. zeigten, dass die Behandlung mit Insulin-like Growth Factor 1 (IGF1) für 3 Tage nach AMI die Herzfunktion nach 1 und 4 Wochen verbesserte. IGF1 induzierte einen M2-ähnlichen anti-inflammatorischen Phänotyp in knochenmarkbasierten Makrophagen und erhöhte die Anzahl der anti-inflammatorischen Makrophagen im Herzgewebe am 3. Tag nach AMI in vivo.
Die Myokardfibrose nach AMI ist ein Merkmal der nachteiligen linksventrikulären Remodellierung. Mittels Western Blotting detektierten wir Typ I- und III-Kollagenfasern, MMP9, TGF-β1 und Caspase 3 in der Grenzzone von Ratten am 28. Tag nach AMI. Die Ergebnisse zeigten, dass die ASX-Behandlung die Expression von Typ I/III-Kollagen reduzierte, was mit den Ergebnissen der Masson-Färbung übereinstimmte. Die Expression der verwandten Proteine MMP9 und TGF-β1 war niedriger als in der AMI-Gruppe. Die Expression des apoptosebezogenen Proteins Caspase 3 wurde ebenfalls in der ASX-Gruppe gehemmt.
Zusammenfassend haben wir vorläufig gezeigt, dass ASX eine schützende Wirkung auf die Myokardfibrose nach AMI hat. Diese Wirkung könnte mit der Makrophagenpolarisation zusammenhängen, aber weitere Forschung ist erforderlich, um den Signalweg zu erforschen und ein neues Ziel für die klinische Behandlung der Myokardremodellierung nach AMI zu bieten.
Es gab einige Einschränkungen in der vorliegenden Studie. Erstens haben wir die schützende Wirkung von ASX auf die Myokardfibrose beobachtet, aber weitere Studien sind erforderlich, um den Signalweg aufzuklären. Darüber hinaus haben wir keine M2-Makrophagenhemmung verwendet, um die Korrelation zwischen ASX-Intervention und M2-Mengenänderung vollständig zu verifizieren, sodass der Beweis, dass ASX die M2-Polarisation fördert, schwach ist.
Zusammenfassend kann die ASX-Behandlung nach AMI, das durch Ligatur der LAD-Arterie bei Ratten induziert wurde, die kardiale Fibrose abschwächen und die M2-Makrophagenpolarisation fördern. Weitere Studien sind erforderlich, um den genauen Mechanismus zu bestimmen.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000000814