Genexpressionsprofile von peripheren mononukleären Blutzellen von Patienten mit atopischer Dermatitis nach Stimulation mit Malassezia globosa

Die atopische Dermatitis (AD) ist eine chronisch entzündliche Hauterkrankung, die durch dysregulierte Immunantworten gekennzeichnet ist. Die Hefe Malassezia, insbesondere Malassezia globosa und Malassezia restricta, wurde aufgrund ihrer Kolonisation auf läsionaler Haut in die Pathogenese der AD einbezogen. Die molekularen Mechanismen, die ihrer Interaktion mit Wirtsimmunzellen zugrunde liegen, bleiben jedoch unklar. Diese Studie untersuchte die transkriptomischen Veränderungen in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von AD-Patienten und gesunden Kontrollen nach Stimulation mit M. globosa, um deren Rolle bei der Immun dysregulation zu klären.

Studiendesign und Teilnehmercharakteristika

Die Studie umfasste drei männliche Patienten mit schwerer AD (Eczema Area and Severity Index [EASI] Scores >21) und drei altersangepasste gesunde männliche Kontrollen. Die AD-Patienten waren 8, 10 und 12 Jahre alt mit EASI-Scores von 22,7, 24,2 und 55,2. Die gesunden Kontrollen waren 8, 9 und 13 Jahre alt. Ausschlusskriterien waren die kürzliche Anwendung von Glukokortikoiden, Immunsuppressiva, Antihistaminika, topischen Medikamenten oder das Vorliegen von Hauterkrankungen, Krebs oder schweren systemischen Erkrankungen. Die ethische Genehmigung wurde vom Ethikkomitee der Klinischen Medizinischen Hochschule und des Ersten Affilierten Krankenhauses der Chengdu Medical College (Nr. 2018CYFYHEC-BA-28) erteilt, wobei die Deklaration von Helsinki eingehalten wurde. Die informierte Einwilligung wurde von allen Teilnehmern eingeholt.

Isolierung und Stimulation von PBMCs

Peripheres Blut (5 mL) wurde von jedem Teilnehmer entnommen und über Lymphozyten-Trennmedium (Hao Yang, Tianjin, China) geschichtet. Nach Zentrifugation bei 2.000 U/min für 25 Minuten wurde die PBMC-Schicht entnommen, zweimal gewaschen und in Kulturmedium (RPMI-1640 mit 20 % fötalem Rinderserum, 100 U/mL Streptomycin und 100 µg/mL Penicillin) in einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen/mL resuspendiert. Die Zellen wurden in Sechs-Well-Platten (6 mL/Well) bei 37°C mit 5 % CO₂ für 24 Stunden kultiviert. Anschließend wurden die Zellen in zwei Gruppen aufgeteilt: eine wurde mit 0,6 mL M. globosa (CBS7874)-Suspension (1 × 10⁶ Zellen/mL) behandelt, die andere mit Kulturmedium allein. Nach 48 Stunden Inkubation wurden die Zellen zentrifugiert, mit Trizol (Ambion, USA) lysiert und bei −80°C für die RNA-Extraktion gelagert. Die Überstände wurden für die Zytokinanalyse aufbewahrt.

Genexpressionsprofilierung und Datenanalyse

Die Genexpressionsprofilierung wurde mit dem Affymetrix Human Prime View Array (OE Biotech Co., China) durchgeführt. Differenziell exprimierte Gene (DEGs) wurden anhand von Fold Change (≥2) und t-Test (P <0,05) identifiziert. Roh- und Analysedaten wurden im Gene Expression Omnibus (GSE139247) hinterlegt. Die funktionelle Anreicherungsanalyse von Gene Ontology (GO)-Termen und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)-Pfaden wurde durchgeführt. Die Interleukin (IL)-4- und IL-13-Spiegel in den Überständen wurden mittels ELISA (Abcam, UK) quantifiziert.

Differenzielle Genexpression bei AD-Patienten vs. gesunden Kontrollen

Die Stimulation mit M. globosa induzierte 356 DEGs (188 hochreguliert, 168 herunterreguliert) in PBMCs von AD-Patienten und 110 DEGs (60 hochreguliert, 50 herunterreguliert) in gesunden Kontrollen. Nur zehn überlappende Gene (8 hochreguliert, 2 herunterreguliert) wurden zwischen den Gruppen geteilt, was auf unterschiedliche transkriptionelle Antworten hinweist. Die Clusteranalyse bestätigte konsistente Expressionstrends innerhalb jeder Gruppe.

Angereicherte funktionelle Terme und Pfade bei AD-Patienten

Die GO-Analyse zeigte eine signifikante Anreicherung von Prozessen im Zusammenhang mit DNA-Methylierung und Histonmodifikation bei AD-Patienten. Schlüsselenzyme umfassten DNMT3L (2,44-fach herunterreguliert) und TDG (2,46-fach hochreguliert), was auf eine veränderte epigenetische Regulation hindeutet. Die Pfadanalyse hob die Aktivierung folgender Pfade hervor:

1. Fc-Gamma-Rezeptor (FcgR)-Pfad: Beteiligt an Phagozytose und Immun komplex-Clearance.
2. Fc-Epsilon-Rezeptor (FceRI)-Pfad: Verbunden mit Mastzellaktivierung und Th2-Zytokinproduktion.
3. Ras-Pfad: Reguliert die Endozytose von Monozyten/Makrophagen.
4. NOD-ähnlicher Rezeptor (NLR)-Pfad: Vermittelt die antigenspezifische T-Zell-Differenzierung.

Im Gegensatz dazu zeigten gesunde Kontrollen eine Anreicherung in weniger Pfaden, ohne Überschneidung mit den Signalpfaden der AD-Patienten.

Zytokinproduktion und Validierung

ELISA bestätigte erhöhte IL-4- und IL-13-Spiegel in den Überständen von M. globosa-stimulierten AD-PBMCs, was mit den transkriptomischen Daten übereinstimmt. Dies unterstützt die Rolle von M. globosa bei der Induktion von Th2-polarisierten Immunantworten, einem Kennzeichen der AD.

Mechanistische Einblicke in die durch M. globosa induzierte Immun dysregulation

Die Studie schlägt ein Modell vor, bei dem M. globosa-Antigene durch Monozyten/Makrophagen über FcgR-vermittelte Endozytose internalisiert werden, wodurch Immun komplexe gebildet werden. Diese Komplexe aktivieren FceRI auf Mastzellen, was die PI3K-abhängige Produktion von IL-4, IL-5 und IL-13 auslöst. Gleichzeitig verstärken Ras- und NLR-Pfade die Antigenpräsentation und T-Zell-Aktivierung, was die Entzündung verstärkt. Epigenetische Modifikationen, wie reduzierte DNA-Methylierung (DNMT3L-Herunterregulation) und erhöhte Demethylierung (TDG-Hochregulation), könnten die Immunregulation weiter destabilisieren, indem sie die Überexpression von FceRI fördern.

Divergierende Antworten bei AD vs. gesunden Kontrollen

Die minimale Überlappung in DEGs und Pfaden zwischen AD-Patienten und Kontrollen unterstreicht den Einfluss des genetischen und immunologischen Hintergrunds auf die Wirt-Pathogen-Interaktion. AD-Patienten zeigen eine erhöhte Sensitivität gegenüber M. globosa, wahrscheinlich aufgrund einer bereits bestehenden Immun dysregulation, während gesunde Kontrollen eine zurückhaltendere Antwort zeigen.

Schlussfolgerung

Diese Studie bietet umfassende Einblicke in die transkriptomischen Effekte von M. globosa auf PBMCs bei AD. Zu den wichtigsten Ergebnissen gehören die Identifizierung von Th2-verschiebenden Pfaden, epigenetischen Modifikatoren und Pathogen-Erkennungsmechanismen, die gemeinsam zur AD-Pathogenese beitragen. Diese Ergebnisse heben potenzielle therapeutische Ziele, wie FcgR/FceRI-Signalgebung und epigenetische Enzyme, zur Modulation der durch Malassezia verursachten Entzündung bei AD hervor.

doi.org/10.1097/CM9.0000000000001512