Anwendung der Einzelzellsequenzierung bei Autoimmunerkrankungen
Das Humangenomprojekt war entscheidend für die Entschlüsselung der Geheimnisse des Lebens, die Erforschung der Pathogenese von Krankheiten und die Bereitstellung wissenschaftlicher Beweise für die Diagnose und Behandlung verschiedener Erkrankungen. Traditionelle Sequenzierungsmethoden haben hauptsächlich genomweite Sequenzinformationen und einen Durchschnitt der Mischung von Zelltypen geliefert, was die Heterogenität zwischen Zellen und zwischen Subtypen nicht berücksichtigt. Fortschritte in der Genomsequenzierungstechnologie haben zur Entwicklung der Einzelzellsequenzierung (SCS) geführt, die Genom-, Transkriptom- und epigenetische Sequenzierung umfasst. SCS enthüllt die genetische Struktur und den Genexpressionsstatus einzelner Zellen, deckt Unterschiede im genetischen Material und in der Proteininformation in Zellen auf und liefert Informationen über die verschiedenen Stadien, Funktionen und Eigenschaften von Zellen.
Um SCS durchzuführen, müssen einzelne Zellen zunächst isoliert werden, wobei ihre biologische Integrität erhalten bleibt. Die Integrität des Genoms (DNA oder RNA) sollte auch während der Zelllyse gewährleistet sein, was durch physikalische Methoden, chemische Methoden oder bioenzymatischen Abbau erreicht werden kann. Nach der Lyse werden DNA-Polymerase und Primer verwendet, um das Genom zu amplifizieren. Schließlich werden einzelne Zellen sequenziert und die Ergebnisse analysiert. Die SCS-Technologie wird heute weitgehend in der immunologischen Forschung eingesetzt, was eine effiziente Diagnose von Autoimmunerkrankungen, die Bestimmung der molekularen Anfälligkeit spezifischer Zellen und die Identifizierung potenzieller therapeutischer Ziele ermöglicht.
Häufige rheumatische Erkrankungen, die hauptsächlich die Gelenke betreffen, umfassen Osteoarthritis (OA) und rheumatoide Arthritis (RA). OA ist durch eine deutliche Knorpelschädigung und nicht durch Entzündung gekennzeichnet. Knorpel besteht aus Chondrozyten, einschließlich proliferativer Chondrozyten, prähypertropher Chondrozyten, hypertropher Chondrozyten und Fibrochondrozyten. Ji et al. erhielten 1.464 Chondrozyten von zehn Patienten mit OA, die sich einer Knieendoprothetik unterzogen, und verwendeten Einzelzell-RNA-Sequenzierung, um die molekularen Programme und die Abstammungsfortschrittsmuster zu berichten, die die Pathogenese von OA kontrollieren. Sie identifizierten sieben Populationen von Chondrozyten im menschlichen OA-Knorpel, von denen drei Effektor-Chondrozyten, regulatorische Chondrozyten und homöostatische Chondrozyten sind. Effektor-Chondrozyten sind am Energiestoffwechsel beteiligt. Regulatorische Chondrozyten spielen wichtige Rollen bei der Antigenpräsentation und der B-Zell- und T-Zell-Rezeptor-Signalübertragung und können als Hauptregulatoren während des OA-Fortschritts fungieren. Homöostatische Chondrozyten exprimieren hohe Spiegel von Markern des menschlichen circadianen Rhythmus und günstigen Genen (wie Period 1 [Per1] und Sirtuin 1 [Sirt1]), die den circadianen Rhythmus im OA-Fortschritt kontrollieren.
RA ist durch eine abnorme synoviale Hyperplasie der Gelenke und die Zerstörung von Knorpel und Knochen gekennzeichnet. Fibroblasten-ähnliche Synovialzellen (FLSs) und Makrophagen spielen eine zentrale Rolle bei der Gelenkentzündung und Knorpeldegeneration während des RA-Fortschritts. Basierend auf Zelloberflächenfärbungsmustern, Transkriptom und anatomischen Lokalisationen können Zellen in einzigartige Subtypen unterteilt werden. Die Identifizierung anatomisch diskreter und funktionell distinkter Zellsubtypen mit nicht überlappenden Funktionen war entscheidend für die Entwicklung zellbasierter Therapien bei RA. Die Einzelzell-RNA-Seq-Analyse wurde verwendet, um nicht-hämatopoetische geweberesidente Fibroblasten zu untersuchen und die Subpopulationen von Zellen in pathologischen Geweben zu definieren, wodurch neue Einblicke in die Krankheitsätiologie und Behandlungsoptionen geliefert wurden.
Verschiedene FLS-Subtypen haben unterschiedliche räumliche Lokalisationen und Funktionen im Synovialgewebe. THY-1 (CD90) ist ein Oberflächenmarker, der verwendet werden kann, um Fibroblasten-Subtypen zu unterscheiden. Bei RA und OA sind THY1+ FLSs in den Sublining-Bereichen vorhanden, während THY1– FLSs hauptsächlich in der Synovialauskleidung zu finden sind. Bei RA exprimiert ein größerer Anteil der FLSs hohe THY1-Spiegel im Vergleich zu OA, und die Mehrheit der FLSs ist THY1– bei OA. THY-1+ FLSs produzieren Zytokine, die Entzündungen antreiben, und sind in Modulen angereichert, die mit der Produktion und den Interaktionen der extrazellulären Matrix (ECM) verbunden sind, während THY-1– FLSs Knochen- und Knorpelzerstörung induzieren. Fibroblasten-Aktivierungsprotein-a (Fap-a) ist ein Biomarker der Gewebeentzündungsreaktion, und die Migration von Fap-a+ FLSs in Knochen und Knorpel führt zu Gelenkschäden. Umgekehrt unterdrückt die Deletion von FAPa+ FLSs sowohl Entzündung als auch Knochenerosion. Das Vorhandensein von FAPa+-THY1+ Immun-Effektor-Fibroblasten in der Synovial-Sublining-Schicht führt zu einer schwereren und anhaltenderen entzündlichen Arthritis mit minimaler Wirkung auf Knochen und Knorpel. FAPa+THY1– destruktive Fibroblasten, die auf die Synovialauskleidungsschicht beschränkt sind, vermitteln jedoch selektiv Knochen- und Knorpelschäden mit geringer Wirkung auf die Entzündung.
Podoplanin (PDPN), eine Art Sialinsäure-Glykoprotein, ist ein Transmembranprotein, das auf der Oberfläche von FLSs gefunden wird. Der Expressionslevel von PDPN in FLSs in vitro steigt zeitabhängig nach Stimulation mit Tumornekrosefaktor (TNF) a und Interleukin (IL)-1b. PDPN+FAPa+THY1+ FLSs erfüllen eine Immun-Effektor-Rolle und erhalten Entzündungen durch die Produktion eines distinkten Repertoires von Chemokinen und Zytokinen aufrecht. PDPN+FAPa+THY1– FLSs sind Knochen-Effektor-Zellen, die Gelenkschäden vermitteln. PDPN+CD34–THY1+ FLSs sind in der perivaskulären Zone im entzündeten Synovium vorhanden und sezernieren proinflammatorische Zytokine. Die Spiegel dieser Zellen sind dreimal höher bei Patienten mit RA im Vergleich zu denen mit OA und spiegeln die RA-Krankheitsaktivität wider. PDPN+CD34–THY1+ FLSs haben ein in vitro-Phänotyp, das für invasive Zellen charakteristisch ist, und sind proliferativ, was darauf hindeutet, dass sie pathologische Rollen bei Matrixinvasion, Immunzellrekrutierung und Osteoklastogenese spielen.
SCS kann verwendet werden, um die dynamische Entwicklung von FLSs zu bestimmen. Nach der Beschreibung der ähnlichen Entwicklungstrajektorie von humanen FLS in OA und RA, klärten Cai et al. auch ihren funktionellen Status durch die Verwendung von Einzelzell-RNA-Sequenzierungstechnologie. Sowohl bei RA als auch bei OA durchliefen FLSs einen ähnlichen Übergangsprozess von einem unstimulierten Zustand (Zustand 4) zu aktivierten Zuständen mit unterschiedlichen funktionellen Mustern (Zustände 1, 2, 3 und 5). Der Prozess kann zwei Zweige haben: (i) von Zustand 4 zu Zustand 5 und (ii) von Zustand 4 zu Zustand 3 zu Zustand 1 oder Zustand 2. FLSs in den Zuständen 2 und 5 sind pathologischer als FLSs in den Zuständen 1 und 3. FLSs in Zustand 5 zeigen eine stärkere proinflammatorische Fähigkeit, während die in Zustand 2 aggressiver sind.
Makrophagen, eine Quelle von TNF-a, treiben RA an. Einzelne Subtypen von RA-Makrophagen haben hochspezialisierte und gewebespezifische Funktionen mit distinkter Transkription und epigenetischer Vererbung. CX3C-Chemokinrezeptor 1 (CX3CR1)+ geweberesidente Makrophagen und heparinbindender epidermaler Wachstumsfaktor-ähnlicher Wachstumsfaktor (HBEGF)+ entzündliche Makrophagen sind in RA-Gewebe angereichert. CX3CR1+ geweberesidente Makrophagen bilden eine interne, lokal erneuernde und schützende Tight-Junction-vermittelte immunologische Barriere, um die Entzündungsreaktion einzuschränken. HBEGF+ entzündliche Makrophagen, bekannt als „proinvasive Makrophagen“, produzieren entzündliche Zytokine wie IL-1 und die EGF-Wachstumsfaktoren Epiregulin und HBEGF, die anschließend invasive FLSs induzieren. Nach den oben genannten Studien haben anatomisch distinkte, funktionell diskrete Fibroblasten- oder Makrophagen-Subtypen mit nicht überlappenden Funktionen wichtige Implikationen für zellbasierte Therapien, die darauf abzielen, Entzündung und Gewebeschäden in pathologischen Zuständen zu modulieren.
Der et al. und Arazi et al. unterzogen menschliche Nieren- und Hautbiopsiegewebe der SCS und bewerteten potenzielle diagnostische und prognostische Marker für Lupusnephritis (LN) sowie identifizierten neue Ziele für personalisierte Behandlung. RNA-Expressionsmuster können eine potenzielle Effektorfunktion und Entwicklungstrajektorie anstoßen. Es gibt verschiedene Leukozyten-Subtypen bei Patienten mit LN, jeder mit einem charakteristischen Genexpressionsmuster. CD8+ T-Zellen sind in zwei distinkte Effektorpopulationen unterteilt, einschließlich einer Population von zytotoxischen T-Zellen mit einer hohen Ähnlichkeit zu natürlichen Killerzellen und einer separaten Population mit einer hohen Expression von Granzym K. Die CD4+ T-Zellpopulation umfasst Effektorpopulationen, Treg-Zellen und T-follikuläre Helfer-ähnliche Zellsubtypen, die zur B-Zell-Reaktion beitragen können. Die SCS-Trajektorienanalyse deutete darauf hin, dass naive B-Zellen sich in aktivierte Zellen und altersbedingte und/oder autoimmunbedingte B-Zellen differenzieren können, was in situ auftreten kann. Die angeborenen und adaptiven Immunzellen in der LN-Niere interagieren miteinander durch Rezeptor-Liganden-Bindung. Die Expression des Chemokinrezeptors C-X-C-Chemokinrezeptor Typ 4 (CXCR4) und des Zytokinrezeptors TNF RSF10A war in renalen Immunzellen erhöht. Darüber hinaus können CXCR4 und CX3CR1 eine zentrale Rolle beim Zelltransport spielen und als potenzielle therapeutische Ziele dienen. Die ECM-interagierenden Proteine Tissue Inhibitor of Metalloproteinases-1 und Serinproteaseinhibitorfamilie G sind mit renaler Fibrose assoziiert und sind in den renalen Tubuluszellen von Patienten mit LN, die eine unwirksame Behandlung erhalten, hochreguliert. Typ-I-Interferon reguliert die Aktivität des Immunsystems, und Typ-I-Interferon-Antwortweg-Gene sind in renalen Tubulusepithelzellen und Keratinozyten bei Patienten mit LN hochreguliert. Typ-I-Interferon kann verwendet werden, um die therapeutische Reaktion auf LN zu bewerten, da die renalen Tubulusepithelzellen-Interferon-Antwort-Scores bei Patienten mit unwirksamer LN-Behandlung signifikant höher sind als bei denen, die eine wirksame Behandlung erhalten. Interferon ist in Keratinozyten von Nicht-Hautläsionen und Nicht-Sonnenbrand-Hautbiopsien vorhanden, die von LN-Patienten erhalten wurden, was darauf hindeutet, dass die Haut als potenzieller Ersatz der Niere für Nierenerkrankungen dienen kann. Urin ist leicht zu sammeln, und Zellen, die im Urin vorhanden sind, können molekulare Veränderungen, die in der Niere auftreten, rekapitulieren und können daher in zukünftigen Biomarkerstudien verwendet werden.
Systemische Sklerose (SSc) ist eine autoimmune fibrotische Erkrankung. Sun et al. identifizierten Hautzellsubtypen und verwandte Markergene bei Patienten mit SSc unter Verwendung von Einzelzell-RNA-Sequenzierung. Sie enthüllten perizyten-spezifische Expression von RGS5, T-Zell-spezifische Expression von IL32, endothelialzell-spezifische Expression von von Willebrand-Faktor (vWf), fibroblasten-spezifische Expression von COL1A1, basale Keratinozyten-spezifische Expression von Krt14 und Krt5 und basale Keratinozyten-spezifische Expression von Krt1 und Krt10. Mesenchymale Zellen in der intestinalen Lamina propria sind eine heterogene Gruppe von Zellen, die entscheidend für die Aufrechterhaltung der Homöostase von intestinalen Epithelzellen sind. Darüber hinaus sind sie mit der Entwicklung von entzündlichen Darmerkrankungen, einschließlich Colitis ulcerosa und Morbus Crohn, verbunden, indem sie das entzündliche Umfeld vermitteln. Kolonmesenchymale Zellen haben vier Subtypen. Der S1-Subtyp ist reich an nicht-fibrillären Kollagenen und elastischen Fasern. Der S2-Subtyp befindet sich in der Nähe der intestinalen epithelialen Krypten und ist durch die Expression von SOX6, F3 (CD142) und WNT gekennzeichnet, die eine wichtige Rolle bei der Stammzellproliferation und -differenzierung spielen. Der S2-Subtyp ist bei Colitis ulcerosa reduziert, und die Expression von schuppigem Kollagen ist verringert, was zu einer epithelialen Barrierefunktionsstörung führt. Der S3-Subtyp ist mit supramolekulärem Fasergewebe assoziiert. Der S4-Subtyp exprimiert Entzündungsfaktoren, die die T-Zell-Aktivierung und Leukozytenmigration regulieren, oxidativen Stress verschlimmern und den Krankheitsfortschritt fördern.
Multiple Sklerose (MS) ist eine entzündliche demyelinisierende Erkrankung, die stark mit Genetik assoziiert ist. Eomesodermin (EOMES) ist mit einem erhöhten Risiko bei chinesischen Patienten mit schubförmig-remittierender MS (RRMS) verbunden und könnte ein potenzielles therapeutisches Ziel bei RRMS sein. Astrozyten sind an der Pathogenese von MS beteiligt. Es gibt mehrere Subtypen von Astrozyten mit unterschiedlichen Transkriptionszuständen in experimenteller allergischer Enzephalomyelitis und MS. Cluster 4 ist die am meisten amplifizierte Subpopulation während der Induktion der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE). Der transkriptionelle Regulatorfaktor Nuklearfaktor Erythroid-2-verwandter Faktor-2 (Nfe2L2), der den Transkriptionsfaktor NRF2 kodiert, hat die niedrigste Expression in Cluster 4 und ist mit erhöhtem MAF bZIP-Transkriptionsfaktor G (MAFG) und MAFG, der direkt mit Methionin-Adenosyltransferase-2 (GMAT2 MAF)-Signalübertragung interagiert, begleitet. NRF2 wirkt als ein negativer Regulatorfaktor, der mit der Entzündungsreaktion und neurotoxischen Wegen verbunden ist. Wenn MS nicht rechtzeitig und effektiv behandelt wird, wird das Nervensystem irreversibel geschädigt. Daher ist die Identifizierung neuer Biomarker wichtig für die Früherkennung von MS und kann potenzielle therapeutische Ziele liefern.
Die SCS-Technologie kann unser Verständnis der Funktion einzelner Zellen im entzündlichen Mikroumfeld bei Autoimmunerkrankungen verbessern und Zellsubtypen in pathologischen Geweben definieren. Darüber hinaus kann SCS die Identifizierung diagnostischer oder prognostischer Biomarker und therapeutischer Ziele für Autoimmunerkrankungen ermöglichen.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000001050