Anwendung der RNA-Sequenzierungstechnologie zur Erforschung des Reparaturmechanismus von Tuina am Musculus gastrocnemius bei Ratten mit Ischiasnervverletzung
Die periphere Nervenverletzung (PNI) bezieht sich auf Schäden am peripheren Nervengeflecht, Nervenstamm oder dessen Äste, die durch äußere Kräfte verursacht werden. Skelettmuskelzellen spielen eine bedeutende Rolle bei der Nervenreparatur aufgrund ihrer starken sekretorischen Funktion und ihrer Fähigkeit, sich in Schwann-Zell-ähnliche Zellen oder andere Zelltypen zu differenzieren, wodurch sie die Regeneration peripherer Nerven fördern. Tuina, eine traditionelle chinesische manuelle Therapie, hat gezeigt, dass sie Symptome wie Muskelkrämpfe und Schmerzen, die durch Nervenschäden verursacht werden, lindern kann. Diese Studie zielte darauf ab, die Auswirkungen von Tuina auf die Erholung von Ischiasnervverletzungen (SNI) bei Ratten zu untersuchen, wobei der Schwerpunkt auf Veränderungen der Muskelkraft der Hinterbeine und genetischen Veränderungen im Musculus gastrocnemius unter Verwendung der RNA-Sequenzierungstechnologie lag.
Experimentelles Design und Methodik
Die Studie umfasste 27 männliche Sprague-Dawley (SD) Ratten im Alter von 6 Wochen mit einem Gewicht von 200 ± 10 g. Die Ratten wurden zufällig in drei Gruppen eingeteilt: die Sham-Gruppe, die SNI-Gruppe und die Tuina-Gruppe. Vor der Operation wurden die Ratten 24 Stunden lang nüchtern gehalten und dann mit einer intraperitonealen Injektion von 1% Pentobarbitalnatrium (0,35 mL/100 g) anästhesiert. Die Ratten wurden in Bauchlage fixiert, und die rechte Hüft-Oberschenkel-Verbindung wurde mit Jodophor vorbereitet, rasiert und erneut sterilisiert. Ein 1 cm langer Schnitt wurde entlang der Richtung des Ischiasnervs gemacht, wodurch der untere Rand des Piriformis freigelegt wurde. Der Ischiasnerv wurde identifiziert, sterilisiert und in der Sham-Gruppe genäht. In der SNI- und Tuina-Gruppe wurde der Ischiasnerv 5 mm distal des Knotens mit Hämostatypinzette für 5 Sekunden mit voller Kraft (6 N) geklemmt, wodurch ein 2 mm langer Verletzungspunkt entstand. Das Gebiet wurde dann mit Salzlösung gespült, und die Wunde wurde sterilisiert und genäht.
Nach der Operation konnten die Hinterbeine der Ratten in der Sham-Gruppe innerhalb eines Tages frei bewegt werden. Im Gegensatz dazu zeigten die Ratten in der SNI- und Tuina-Gruppe gestreckte Kniegelenke mit begrenzter Beugung und Hinken, was auf eine erfolgreiche Modellierung der Ischiasnervverletzung hinwies. Die Ratten in der Sham- und SNI-Gruppe wurden routinemäßig gefüttert, während die Tuina-Gruppe am 7. Tag nach der Operation mit der Behandlung begann. Tuina-Techniken, einschließlich Punktdruck, Zupfen und Kneten, wurden an den Punkten Yinmen (BL37), Chengshan (BL57) und Yanglingquan (GB34) auf der betroffenen Seite einmal täglich für 9 Minuten angewendet. Die Behandlung wurde an 10 aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt, gefolgt von einem Ruhetag, und dann für weitere 10 Tage wiederholt, insgesamt 20 Behandlungen. Um Stress zu reduzieren, wurden die Ratten vor jeder Intervention 9 Minuten lang gestreichelt.
Verhaltenstests und Muskelkraftbewertung
Ein elektrisch geneigter Plattentester wurde verwendet, um Veränderungen der Muskelkraft der Hinterbeine zu messen. Verhaltenstests wurden vor der Operation und an den Tagen 0, 5, 10, 15 und 20 der Intervention durchgeführt. Die Köpfe der Ratten wurden auf das Brett gelegt, und der Winkel wurde schrittweise erhöht, bis die Ratten ihre Position nicht mehr für 5 Sekunden halten konnten. Der kritische Winkel wurde aufgezeichnet, und der Durchschnitt von drei Messungen wurde genommen.
RNA-Sequenzierung und Datenanalyse
Nach der Intervention wurden neun Ratten aus jeder Gruppe anästhesiert, und das rechte Musculus gastrocnemius-Gewebe wurde entnommen. Die Gesamt-RNA wurde aus dem Gewebe von drei Ratten extrahiert, als Probe gemischt, und jede Gruppe hatte drei biologische Replikate. Die RNA-Sequenzierung wurde durchgeführt, und die Daten wurden mit SPSS 22.0 analysiert. Eine einfache Varianzanalyse (ANOVA) wurde verwendet, um die Gruppen zu vergleichen.
Ergebnisse
Die Ergebnisse des geneigten Plattentests zeigten keine signifikanten Unterschiede im Winkel vor der Operation zwischen den Gruppen. Der Winkel verringerte sich jedoch signifikant in der SNI- und Tuina-Gruppe im Vergleich zur Sham-Gruppe vor der Intervention (7 Tage nach der Operation). Bis zur 10. Intervention zeigte die Tuina-Gruppe einen signifikanten Anstieg des geneigten Plattentestwinkels im Vergleich zur SNI-Gruppe (P < 0,05), mit weiteren Anstiegen in der 15. und 20. Intervention (P < 0,01). Die Tuina-Gruppe zeigte jedoch immer noch signifikante Unterschiede im Vergleich zur Sham-Gruppe.
Die RNA-Sequenzierung ergab 44 differentiell exprimierte Gene (DEGs) zwischen der Sham- und Tuina-Gruppe. Vier Gene in der Sham-Gruppe und 20 Gene in der Tuina-Gruppe zeigten signifikante Unterschiede im Vergleich zur SNI-Gruppe. Die Genontologie (GO)-Analyse zeigte, dass DEGs an zellulären Prozessen, Einzelorganismusprozessen, Stoffwechselprozessen, Regulation biologischer Prozesse, Reaktion auf Reize, Zellteilen, Zellen, Organellen und Bindung beteiligt waren. GO-Funktionen waren in der Regulation der Komplementaktivierung, Reaktion auf Reize, zelluläre Seneszenz und Wnt-Signalweg, der an der Morphogenese des Verdauungstrakts beteiligt ist, angereichert. Die Kyoto-Enzyklopädie der Gene und Genome (KEGG)-Pfadanalyse zeigte Beteiligung an Aminosäurestoffwechsel, Lipidstoffwechsel, Stoffwechsel von Cofaktoren und Vitaminen, Biodegradation und Stoffwechsel von Xenobiotika, Immunsystem, Nervensystem, Immunerkrankungen und neurodegenerativen Erkrankungen. KEGG-Pfade waren in der Zytokin-Zytokin-Rezeptor-Interaktion, chemischen Karzinogenese und AMPK-Signalweg angereichert.
Diskussion
Die Ergebnisse des geneigten Plattentests zeigten, dass Tuina die Erholung und Regeneration von SNI förderte, Verbindungen zwischen verletzten Nerven und Zielorganen erleichterte und die Atrophie des Musculus gastrocnemius verzögerte. Die DEGs-Analyse hob hervor, dass Ankrd1 (Ankyrin-Repeat-Domäne 1) die größte hochregulierte Expression in der GO-Anreicherung hatte, während Eda2r (Ektodysplasin A2 Rezeptor) die größte hochregulierte Expression in der KEGG-Anreicherung zeigte. IL12rb2 (Interleukin-12-Rezeptor-Untereinheit beta 2) zeigte die größte differentielle Expression in der GO-Funktion und KEGG-Pfad-angereicherten herunterregulierten Expression.
Ankrd1 ist ein Protein, das an der Regulierung der Muskelfaser-Typ-Umwandlung beteiligt ist. Seine zellulären Komponenten umfassen Band I, und die Tuina-Intervention kann die Struktur der Myofilamente anpassen, die Differenzierung des Skelettmuskels regulieren und auf Muskelbelastung reagieren, wodurch die Morphologie des Musculus gastrocnemius stabilisiert und die Nervenreparatur durch Ankrd1-mRNA-Expression im Band I des Musculus gastrocnemius gefördert wird. IL12rb2 spielt eine entscheidende Rolle bei der PNI-Reparatur, während Eda2r die Nervenreparatur durch Regulierung der NF-kB-, JNK- und p53-Signalwege, die mit Analgesie verbunden sind, fördert.
Schlussfolgerung
Tuina förderte die Erholung der Muskelkraft der Hinterbeine bei SNI-Ratten, möglicherweise durch Verbesserung der Genexpression des Musculus gastrocnemius. Die DEGs waren an mehreren biologischen Funktionen und Pfaden beteiligt, was darauf hindeutet, dass der Reparaturmechanismus von Tuina mit zellulären Prozessen, Einzelorganismusprozessen, Reaktion auf Reize und Zytokin-Zytokin-Rezeptor-Interaktion, AMPK und anderen Signalwegen zusammenhängen könnte. Die Regulation der Genexpression von Ankrd1, IL12rb2 und Eda2r im Musculus gastrocnemius könnte ebenfalls zur Reparatur von SNI bei Ratten beitragen.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000001960