Diagnose der renalen Amyloidose durch Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie: Erfahrungen aus einer monozentrischen Kohortenstudie in China
Amyloidose ist eine komplexe und heterogene Gruppe von Erkrankungen, die durch die extrazelluläre Ablagerung von unlöslichen beta-Faltblatt-Proteinfibrillen in verschiedenen Geweben gekennzeichnet ist. Die Krankheit wird basierend auf dem spezifischen Typ des involvierten Vorläuferproteins klassifiziert, und die genaue Identifizierung dieser Proteine ist entscheidend für die Bestimmung der geeigneten Behandlungsstrategie. Über 30 verschiedene Proteine wurden in der Pathogenese der Amyloidose identifiziert, was die präzise Amyloidtypisierung zu einem kritischen Bestandteil des diagnostischen Prozesses macht. Traditionell basiert die Diagnose der Amyloidose auf histopathologischen Techniken wie der Kongorot-Färbung (CR), die unter polarisiertem Licht eine apfelgrüne Doppelbrechung zeigt, und der Elektronenmikroskopie, die die charakteristischen 7 bis 12 nm verzweigten Fibrillen offenbart. Diese Methoden allein reichen jedoch nicht aus, um den spezifischen Typ des Amyloidproteins zu identifizieren. Immunfluoreszenz (IF) und Immunhistochemie (IHC) wurden eingesetzt, um Amyloidablagerungen weiter zu klassifizieren, aber ihre Genauigkeit hängt stark von der Qualität und Spezifität der verwendeten Antikörper ab. In den letzten Jahren hat sich die Laser-Mikrodissektion in Kombination mit Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LMD/MS) als leistungsstarkes Werkzeug für die Amyloidtypisierung etabliert, das einen umfassenderen und antikörperunabhängigen Ansatz zur Proteinidentifizierung bietet.
Diese Studie, die am Peking Union Medical College Hospital in China durchgeführt wurde, zielte darauf ab, den diagnostischen Nutzen von LMD/MS bei renaler Amyloidose zu bewerten und seine Leistung mit traditionellen IHC-Methoden zu vergleichen. Die Forscher analysierten retrospektiv klinische und pathologische Daten von Patienten, bei denen zwischen 2010 und 2015 eine renale Amyloidose diagnostiziert wurde. Insgesamt wurden 59 Patienten in die Studie eingeschlossen, und ihre Fälle wurden basierend auf dem Nachweis oder Fehlen eines monoklonalen Proteins (M-Protein) durch Serum-Immunfixationselektrophorese (IFE) in zwei Gruppen eingeteilt. Die erste Gruppe, bestehend aus 51 Patienten mit Nachweis eines M-Proteins, wurde als Leichtketten-Amyloidose (AL) klassifiziert. Die zweite Gruppe, bestehend aus 8 Patienten ohne Nachweis eines M-Proteins, wurde als Nicht-Leichtketten-Amyloidose (non-AL) klassifiziert.
Innerhalb der AL-Gruppe zeigten 20 Fälle Inkonsistenzen zwischen den Ergebnissen der renalen IF und der Serum-IFE. Diese Fälle wurden weiter mit IHC für Kappa (κ)- und Lambda (λ)-Leichtketten analysiert und anschließend mit LMD/MS validiert. In der non-AL-Gruppe wurden Nierenbiopsiegewebe direkt der LMD/MS-Analyse unterzogen. Die Studie wurde gemäß der Deklaration von Helsinki durchgeführt und von der Ethikkommission des Peking Union Medical College Hospital genehmigt. Alle Patienten gaben eine schriftliche Einwilligung zur Teilnahme an der Studie.
Die LMD/MS-Analyse wurde an formalinfixierten, paraffineingebetteten Nierenbiopsieproben mit einem Linear Trap Quadrupole Orbitrap Velos Pro Massenspektrometer (Thermo Fisher Instruments, San Jose, USA) durchgeführt. Die Proteinidentifizierung erfolgte mit der Mascot-Datenbanksuchmaschine (Matrix Science, London; Version 2.3.02) gegen die UniProt-Humandatenbank, die 84.910 Einträge enthält. Die Suche wurde mit einer Peptid- und Produktionentoleranz von 0,05 Da durchgeführt. Die Scaffold-Software (v 4.3.2, Proteome Software Inc., Portland, OR, USA) wurde verwendet, um die Suchergebnisse mit der Decoy-Datenbankmethode zu filtern. Die Proteinidentifizierung wurde akzeptiert, wenn mindestens zwei eindeutige Peptide nachgewiesen wurden und die falsche Entdeckungsrate auf Proteinebene weniger als 1% betrug.
Die Diagnose der Amyloidose auf proteomischer Ebene basierte auf dem Nachweis von Serum-Amyloid-Protein, Apolipoprotein E und Amyloid-Vorläuferproteinen. Quantitative Informationen zu jedem Protein wurden aus der Anzahl der identifizierten Peptide abgeleitet, und der Typ der Amyloidose wurde basierend auf der höchsten Häufigkeit von Proteinen bestimmt, die dem spezifischen Amyloidtyp entsprechen. Es waren mindestens vier Massenspektren erforderlich, um eine signifikante Amyloidablagerung nachzuweisen.
Die Ergebnisse der Studie zeigten mehrere wichtige Erkenntnisse. Unter den 20 AL-Gruppen-Patienten mit inkonsistenten IF- und IFE-Ergebnissen konnte IHC in 11 Fällen klare diagnostische Informationen liefern, was einer diagnostischen Sensitivität von 55% entspricht. In den verbleibenden 9 Fällen konnte IHC nicht zwischen AL-κ und AL-λ unterscheiden. Im Gegensatz dazu lieferte LMD/MS in allen 11 Fällen mit klaren IHC-Befunden konsistente Ergebnisse und konnte 6 der 9 Fälle mit unklarer IHC-Färbung präzise klassifizieren. Insgesamt konnte LMD/MS 17 der 20 Fälle in der AL-Gruppe erfolgreich diagnostizieren, was einer diagnostischen Sensitivität von 85% entspricht. Dies zeigt die überlegene Genauigkeit und Sensitivität von LMD/MS im Vergleich zu IHC bei der Amyloidtypisierung.
In der non-AL-Gruppe konnte LMD/MS spezifische Amyloidtypen in 6 von 8 Fällen identifizieren. Dazu gehörten ein Fall von AA-Amyloidose, ein Fall von Apolipoprotein A-IV (ApoA IV)-Amyloidose, drei Fälle von AL-κ-Amyloidose und ein Fall von AL-λ-Amyloidose. Die verbleibenden zwei Fälle konnten nicht klassifiziert werden, was die Herausforderungen bei der Diagnose seltener oder atypischer Formen von Amyloidose unterstreicht.
Die Studie lieferte auch Einblicke in die Prävalenz verschiedener Typen von systemischer Amyloidose in der Niere. AL-Amyloidose war der häufigste Typ, gefolgt von AA-Amyloidose und ApoA IV-Amyloidose. Interessanterweise wurden in dieser Kohorte keine Fälle von Leukozyten-Chemotaxis-Faktor 2-Amyloidose (ALECT2) identifiziert, obwohl über eine Prävalenz in hispanischen Bevölkerungen berichtet wurde. Die geringe Anzahl von non-AL-Amyloidose-Fällen in der Studie begrenzte die Möglichkeit, weitergehende Schlussfolgerungen über die Verteilung dieser seltenen Amyloidtypen zu ziehen.
Die Ergebnisse dieser Studie unterstreichen die Bedeutung einer genauen Amyloidtypisierung für die Steuerung von Behandlungsentscheidungen und die Verbesserung der Patientenoutcomes. Während traditionelle Methoden wie IF und IHC weiterhin weit verbreitet sind, zeigen ihre Grenzen in Bezug auf Sensitivität und Spezifität die Notwendigkeit fortgeschrittenerer diagnostischer Techniken. LMD/MS bietet eine vielversprechende Alternative, da es nicht durch die Einschränkungen antikörperbasierter Methoden begrenzt ist und selbst in diagnostisch schwierigen Fällen eine präzise Proteinidentifizierung ermöglicht.
Die Einführung von LMD/MS in die klinische Praxis wird derzeit jedoch durch die hohen Kosten und die Notwendigkeit spezialisierter Ausrüstung und Expertise begrenzt. Derzeit wird LMD/MS hauptsächlich als ergänzendes diagnostisches Werkzeug in Zentren mit den notwendigen Ressourcen eingesetzt. Dennoch ist die zunehmende Anerkennung der Bedeutung der Amyloidtypisierung, insbesondere für seltene und atypische Formen der Amyloidose, wahrscheinlich ein Treiber für die zunehmende Einführung proteomischer Techniken in der Zukunft.
Zusammenfassend zeigt diese Studie, dass LMD/MS eine hochempfindliche und genaue Methode für die Amyloidtypisierung ist, die traditionelle IHC in der Diagnose der renalen Amyloidose übertrifft. Die Fähigkeit von LMD/MS, spezifische Amyloidproteine ohne die Einschränkungen antikörperbasierter Methoden zu identifizieren, macht es zu einem unschätzbaren Werkzeug für die Diagnose komplexer und seltener Formen der Amyloidose. Da sich das Feld der Amyloidproteomik weiterentwickelt, hat die Integration fortgeschrittener Massenspektrometrie-Techniken in die Routine klinische Praxis das Potenzial, die diagnostische Genauigkeit und die Patientenoutcomes erheblich zu verbessern.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000002155