DnaJA4 ist an der Hyperthermieantwort in HaCaT-Zellen durch Regulation der F-Aktin-Expression beteiligt
Einleitung
Aktin ist ein hochkonserviertes, multifunktionelles Protein (≈42 kDa), das in nahezu allen eukaryotischen Zellen vorkommt. Es existiert in zwei Formen: globuläres Aktin (G-Aktin) als monomere Kugel und fibrilläres Aktin (F-Aktin), ein Polymer aus Aktinmonomeren, das den Hauptbestandteil des Zytoskeletts bildet. Beide Formen können sich unter physiologischen Bedingungen reversibel umwandeln, jedoch besitzt nur F-Aktin physiologische Aktivität. Aktin ist an zellulären Prozessen wie Zelladhäsion, Migration, Signaltransduktion und Apoptose beteiligt.
Hitzeschockproteine (HSPs) sind akut reagierende Proteine, deren Expression unter Stressbedingungen wie Hyperthermie oder UV-B-Strahlung ansteigt. DnaJ/HSP40 (≈40 kDa) fungiert als Co-Chaperon von HSP70 und schützt geschädigte Zellen. Hyperthermie (40–44°C für 30–60 Minuten) wird klinisch u. a. bei Brustkrebs oder plantaren Warzen eingesetzt. Frühere Studien zeigten, dass DnaJA4 in HaCaT-Zellen nach Hyperthermie hochreguliert wird und die antivirale Immunität beeinflusst. DnaJA4-Knockout (KO) verstärkt diese Reaktion. Massenspektrometrie-Analysen deuten auf Interaktionen von DnaJA4 mit Zytoskelettproteinen wie Aktin hin. Ziel dieser Studie war es, den Einfluss von DnaJA4 auf F-Aktin in HaCaT-Zellen unter Hyperthermie zu untersuchen.
Methoden
Zelllinien und Kultur
Wildtyp (WT)-HaCaT-Zellen (GENE, Shanghai) und DnaJA4-KO-Zellen (mittels CRISPR/Cas9 generiert) wurden in DMEM mit 10 % fötalem Kälberserum und 1 % Penicillin/Streptomycin bei 37°C und 5 % CO₂ kultiviert.
Hyperthermiebehandlung
Zellen (60–70 % konfluent) wurden 30 Minuten in einem 44°C-Wasserbad inkubiert und nachfolgend bei 37°C für 6, 12 oder 24 Stunden erholt.
F-Aktin-Färbung
Zellen auf Deckgläsern wurden mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, mit 0,1 % Triton X-100 permeabilisiert und mittels Phalloidin-Alexa Fluor 488 sowie DAPI gefärbt. Die Analyse erfolgte mittels konfokaler Mikroskopie.
Durchflusszytometrie
Zellen wurden mit Anti-F-Aktin-Antikörpern inkubiert und mittels BD LSRFortessa analysiert (10.000 Zellen pro Probe).
Western-Blot
Proteinextrakte wurden mittels SDS-PAGE getrennt und mit Antikörpern gegen F-Aktin, RhoA, ROCK1, E-Cadherin, β-Catenin und GAPDH analysiert.
Ergebnisse
Morphologische Veränderungen
Unbehandelte WT-Zellen zeigten zahlreiche Filopodien und lockere Zellverbindungen, während DnaJA4-KO-Zellen fusionierte Zellen mit engeren Verbindungen aufwiesen. Nach Hyperthermie schrumpften WT-Zellen innerhalb von 6 Stunden, erholten sich jedoch nach 24 Stunden. Dagegen zeigten DnaJA4-KO-Zellen keine signifikanten Änderungen des Aktinzytoskeletts.
Hochregulation von F-Aktin in DnaJA4-KO-Zellen
Die Durchflusszytometrie ergab eine erhöhte mittlere Fluoreszenzintensität in DnaJA4-KO-Zellen (6364,33 ± 989,10 vs. 4272,67 ± 918,50; P = 0,014).
Regulation von F-Aktin und Signalwegproteinen
Im Western-Blot sank die F-Aktin-Expression in WT-Zellen 6 Stunden post-Hyperthermie, stieg jedoch nach 12 Stunden an. In DnaJA4-KO-Zellen übertraf die F-Aktin-Expression nach 24 Stunden den Ausgangswert (0,51 ± 0,02 vs. 0,44 ± 0,01; P = 0,001). RhoA und ROCK1 zeigten ähnliche Expressionsprofile. Die E-Cadherin-Expression sank in beiden Zelltypen nach 24 Stunden, blieb in KO-Zellen jedoch höher. β-Catenin zeigte keine Änderungen.
Diskussion
Hyperthermie destabilisiert Zellmembranen, erhöht die Ca²⁺-Konzentration und depolymerisiert F-Aktin. HSPs wie Hsp27 stabilisieren jedoch das Zytoskelett durch F-Aktin-Polymerisation. Die beobachtete initiale Abnahme und spätere Zunahme von F-Aktin spiegelt diese Dynamik wider. DnaJA4-KO verstärkte die F-Aktin-Aggregation, was auf eine hemmende Rolle von DnaJA4 hindeutet.
Der Rho/ROCK-Signalweg reguliert über RhoA und ROCK1 die F-Aktin-Dynamik. Die parallele Regulation dieser Proteine in KO-Zellen unterstreicht ihren Einfluss auf den Aktinstoffwechsel. Die reduzierte E-Cadherin-Expression könnte die Zellmigration fördern, während erhöhte Werte in KO-Zellen auf eine veränderte Proliferation oder Apoptose hinweisen.
Frühere Studien zeigten, dass Hyperthermie die NF-κB-Aktivierung und antivirale Reaktionen verstärkt. Die verringerten Filopodien in KO-Zellen könnten die Virusaufnahme beeinflussen, was weitere Untersuchungen erfordert.
Zusammenfassung
DnaJA4 moduliert die Hyperthermieantwort in HaCaT-Zellen durch Regulation von F-Aktin und assoziierten Signalwegproteinen. Zukünftige Studien mit DnaJA4-überexprimierenden Zellmodellen sollen die Mechanismen weiter aufklären.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000001064