Ein schneller kolloidaler Gold-Immunochromatographie-Assay zur Diagnose der Coronavirus-Krankheit 2019
Der globale Ausbruch der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19), verursacht durch das schwere akute respiratorische Syndrom-Coronavirus-2 (SARS-CoV-2), hat zu weit verbreiteten Pneumonien und schweren Atemwegssyndromen geführt. Während China die Epidemie durch strikte Maßnahmen unter Kontrolle gebracht hat, steigen die bestätigten Fälle und Todesfälle in anderen Ländern weiter an. SARS-CoV-2 ist deutlich ansteckender als seine Vorgänger, das SARS-Coronavirus (SARS-CoV) und das MERS-Coronavirus (MERS-CoV). Eine schnelle und präzise Identifizierung des Virus ist entscheidend, um die Ausbreitung der Krankheit einzudämmen. Derzeit dienen computertomographische Bildgebung und hämatologische Parameter als erste Marker für eine COVID-19-Infektion, während die Reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) zum Nachweis viraler Nukleinsäuren der Goldstandard für die klinische Diagnostik ist. Die RT-PCR ist jedoch zeitaufwendig, erfordert spezialisierte Labore und geschultes Personal und ist anfällig für Schwankungen der Probenqualität. Im Gegensatz dazu bietet der Nachweis spezifischer Serumantikörper mittels kolloidalem Gold-Immunochromatographie-Assay (GICA) eine schnelle, hochempfindliche und gerätefreie Alternative, die ideal für die Point-of-Care-Testung ist.
Ziel dieser Studie war die Entwicklung effizienter GICA-Kits zum Nachweis SARS-CoV-2-spezifischer Immunglobulin (Ig)-M- und IgG-Antikörper im Blut von COVID-19-Patienten. Es wurden zwei Kit-Typen entworfen: Kit A verwendet eine einzelne Testlinie zum Einfangen spezifischer IgM- und IgG-Antikörper gegen das N-Protein von SARS-CoV-2, während Kit B, eine weiterentwickelte Version von Kit A, separate Testlinien für IgG- und IgM-Antikörper zur Unterscheidung aufweist. Beide Kits nutzen kolloidales Gold-markiertes N-Protein von SARS-CoV-2 als Antigen. Für die Kontrolllinie wurden Kaninchen-IgG und Ziegen-anti-Kaninchen-IgG-Antikörper als Antigen bzw. Antikörper ausgewählt.
Die Entwicklung der GICA-Kits umfasste die Präparation kolloidalem Gold-markierten N-Proteins und Kaninchen-IgG. Kurzgefasst wurden 10 mL kolloidale Goldlösung (40 nm) mit 65 mL Kaliumkarbonat (0,1 mol/L) gemischt. Rekombinantes SARS-CoV-2-N-Protein-Antigen wurde schnell hinzugefügt und die Mischung 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 100 mL 20%ige Rinderserumalbumin-Lösung hinzugefügt und weitere 30 Minuten inkubiert. Die Mischung wurde bei 12.000 U/min für 20 Minuten zentrifugiert und mit 5 mL Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS; 50 mmol/L, pH 7,4) gewaschen. Das Pellet wurde in 1,0 mL kolloidalem Gold-Puffer resuspendiert. Das Antigen wurde unter spezifischen Druckbedingungen auf einen Konjugatpad aufgetragen. Analog wurden Maus-anti-human-IgM/IgG-Antikörper und Ziegen-anti-Kaninchen-IgG-Antikörper mit PBS verdünnt und auf eine Nitrocellulose-beschichtete Polyvinylchlorid-Folie gedruckt. Die Folie wurde 6 Stunden bei 37°C getrocknet. Alle Materialien wurden gemäß des Designschemas montiert.
Zur Bewertung der Sensitivität und Spezifität der Kits wurde eine klinische Studie mit Serumproben von 43 bestätigten COVID-19-Patienten und 45 Patienten mit unrelateden Erkrankungen durchgeführt. Die Blutproben stammten vom Ersten Affilierten Krankenhaus und dem Lungenkrankenhaus der Shanxi Medical University, Taiyuan, China (7.–20. Februar 2020). Die Studie folgte der Deklaration von Helsinki und wurde durch die Ethikkommission der Shanxi Medical University genehmigt. Für den Antikörpernachweis wurden 10 mL der Probe auf den Probenpad gegeben, gefolgt von 80 mL Verdünnungslösung. Die Ergebnisse wurden qualitativ nach 15 Minuten anhand der Färbung der IgM- und/oder IgG-Linie sowie der Kontrolllinie bestimmt. Alle Arbeiten erfolgten in einem Biosicherheitslabor der Stufe 3. Die Interpretation war wie folgt: Sichtbare Farbe in der Kontrolllinie und IgM-/IgG-Testlinie weist auf spezifische Antikörper hin. Nur die Kontrolllinie zeigt eine Nicht-Infektion an. Fehlende Färbung der Kontrolllinie deutet auf einen ungültigen Test hin.
Repräsentative Ergebnisse von Kit B zeigten Färbungen in beiden Linien bei COVID-19-Patienten, nicht jedoch bei Kontrollen. Tests mit humanem IgG-Monoklonalantikörper-Referenzmaterial gegen das Nukleokapsidprotein von SARS-CoV-2 wurden durch Western Blot validiert. Die Sensitivitäten von Kit A und Kit B lagen bei 88,3 % bzw. 93,0 % bei einer Spezifität von 100 % für beide Kits. Die höhere Sensitivität von Kit B wird auf die separaten Testlinien zurückgeführt, die IgM- oder IgG-Antikörper effizient einfangen. Zur Minimierung von Bedienerfehlern wurde ein Blindverfahren eingesetzt. Die begrenzte Stichprobengröße könnte jedoch die Sensitivitäts- und Spezifitätswerte überschätzen.
Zusammenfassend wurden zwei schnelle und sensitive GICA-Kits zum Nachweis von SARS-CoV-2-spezifischen Antikörpern entwickelt, die großes Potenzial für die klinische Diagnostik und epidemiologische Überwachung von COVID-19 besitzen. Dieses Assay bietet eine praktische Lösung zur zeitnahen Identifizierung des Virus und trägt zur Eindämmung der Pandemie bei.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000000922