Eine einzelne Kopie von Large Tumor Suppressor 1 oder Large Tumor Suppressor 2 reicht für normale Hämatopoese aus
Hämatopoetische Stammzellen (HSZ) besitzen die bemerkenswerte Fähigkeit zur Selbsterneuerung und Differenzierung in alle Subtypen von Blutzellen, was eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der hämatopoetischen Homöostase spielt. Der Ruhezustand von HSZ ist essenziell für ihre langfristige Funktion und die Bewahrung ihrer Selbsterneuerungskapazität. Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die die HSZ-Ruhe regulieren, ist von zentraler Bedeutung für Einblicke in Geweberegeneration und Stressantworten. Der Hippo-Signalweg, ein Schlüsselregulator der Organgröße und Stammzellfunktion, wurde in verschiedenen Geweben intensiv untersucht. Seine Rolle im hämatopoetischen System bleibt jedoch unklar. Large Tumor Suppressor 1 (LATS1) und Large Tumor Suppressor 2 (LATS2) sind kritische Komponenten des Hippo-Signalwegs und fungieren als Tumorsuppressoren und Stammzellregulatoren. Diese Studie untersucht die Rolle von LATS1 und LATS2 in der normalen Hämatopoese mittels Knockout-Mausmodellen.
Expression von LATS1 und LATS2 in hämatopoetischen Zellen
Die Expression von LATS1 und LATS2 wurde in Subpopulationen primitiver und reifer muriner hämatopoetischer Zellen analysiert. Quantitative Reverse-Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (qRT-PCR) zeigte, dass beide Gene in hämatopoetischen Zellen weit verbreitet exprimiert werden, mit höheren Expressionsniveaus in primitiven Zellen im Vergleich zu reifen Zellen. Insbesondere war die Expression von LATS1 und LATS2 in hämatopoetischen Vorläuferzellen (HPCs) höher als in langfristigen HSZ (LT-HSZs), lymphoid-prämultipotenten Vorläuferzellen (LMPPs), gemeinsamen myeloischen Vorläuferzellen (CMPs), Granulozyten-Monozyten-Vorläuferzellen (GMPs) und megakaryozytär-erythroiden Vorläuferzellen (MEPs). Auffällig war, dass LATS1 in hämatopoetischen Zellen höher exprimiert wurde als LATS2, was auf eine prominentere Rolle von LATS1 in der Hämatopoese hindeutet.
Generierung von LATS1- und LATS2-Knockout-Mäusen
Um die Funktion von LATS1 und LATS2 in der normalen Hämatopoese zu untersuchen, wurden Knockout-Mäuse mittels des CRISPR/Cas9-Systems generiert. Zwei sgRNAs wurden zur Targeting von Exon 4 (LATS1) und Exon 2 (LATS2) entwickelt. Es wurden zwei unabhängige Knockout-Linien pro Gen etabliert, wobei Frameshift-Mutationen durch DNA-Sequenzierung bestätigt wurden. Homozygote Mutanten konnten durch Kreuzung heterozygoter Tiere nicht gewonnen werden, was auf embryonale Letalität hindeutet. Heterozygote Tiere waren lebensfähig und fruchtbar, ohne sichtbare Unterschiede zu Wildtyp-Kontrollen. Die Expression von LATS1 und LATS2 im Knochenmark (KM) war bei heterozygoten Mäusen halbiert, was die erfolgreiche Generierung der Modelle bestätigte.
Normale Hämatopoese in LATS1- und LATS2-Heterozygoten
Der Einfluss der heterozygoten Mutationen auf die Hämatopoese wurde bei 8–12 Wochen alten Mäusen untersucht. Vollblutanalysen zeigten keine Unterschiede in der Anzahl zirkulierender Leukozyten, Neutrophiler, Lymphozyten, Monozyten, Thrombozyten und Erythrozyten sowie der Hämoglobinkonzentration zwischen heterozygoten und Wildtyp-Mäusen. Auch die Gesamtzahl der KM-Zellen war vergleichbar. Durchflusszytometrie-Analysen ergaben keine signifikanten Unterschiede in der Häufigkeit oder absoluten Anzahl früher Vorläuferzellen (HPCs, CMPs, GMPs, MEPs, LMPPs und Lin⁻Sca-1⁺c-Kit⁺ [LSK]-Zellen) oder HSZ (LT-HSZs und CD34⁻-LSK-Zellen). Diese Befunde legen nahe, dass ein einzelnes Allel von LATS1 oder LATS2 für eine normale Hämatopoese ausreicht.
Auswirkung von LATS1- und LATS2-Depletion auf das Überleben
Um die Effekte der Depletion auf die hämatopoetische Rekonstitution zu testen, wurden heterozygote und Wildtyp-Mäuse mit 5-Fluorouracil (5-FU) behandelt, einem Chemotherapeutikum, das proliferierende Zellen abtötet und das hämatopoetische System regeneriert. Nach wöchentlichen Injektionen über drei Wochen starben sowohl heterozygote als auch Wildtyp-Mäuse schrittweise nach der zweiten Injektion, die verbliebenen Tiere nach der dritten. Es gab keine signifikanten Unterschiede im Gesamtüberleben zwischen den Gruppen, was darauf hindeutet, dass die Depletion von LATS1 oder LATS2 die langfristige Selbsterneuerung von HSZ nicht beeinträchtigt.
Diskussion
Der Hippo-Signalweg reguliert Organgröße und Stammzellfunktion in diversen Geweben. LATS1 und LATS2, zentrale Mediatoren dieses Wegs, inhibieren die Transkriptionskoaktivatoren YAP und TAZ. Diese Studie zeigt, dass die Hemmung des Hippo-Signalwegs durch Depletion von LATS1/LATS2 weder Hämatopoese noch HSZ-Funktion beeinflusst. Der Knockout beider Gene führte zur embryonalen Letalität, während heterozygote Tiere eine normale Hämatopoese aufwiesen. Dies unterstreicht, dass ein einzelnes Allel beider Gene ausreicht.
Haploinsuffizienz, bei der ein Allel nicht für die normale Funktion genügt, ist eine häufige Ursache dominanter Erkrankungen. Gene wie Apc oder Npm1 sind in der Hämatopoese haploinsuffizient. Im Gegensatz dazu sind LATS1 und LATS2 nicht dosisabhängig, da ihre Funktionen in Heterozygoten erhalten bleiben.
Der Hippo-Signalweg wird durch Zell-Zell-Kontakte reguliert, die in festen Geweben die Proliferation hemmen. Hämatopoetische Zellen befinden sich jedoch in einer flüssigen Umgebung (Blut/KM), wo kontaktvermittelte Hemmung weniger relevant ist. Dies könnte erklären, warum der Verlust von LATS1/LATS2 in hämatopoetischen Zellen keine Überproliferation verursacht, im Gegensatz zu soliden Geweben.
Neurofibromatose 2 (NF2), ein weiterer Hippo-Regulator, zeigt ähnliche Effekte: Sein Verlust in hämatopoetischen Zellen hat keine Auswirkungen auf HSZ, beeinträchtigt jedoch nichthämatopoetische Zellen der KM-Mikroumgebung. Dies unterstreicht kontextspezifische Funktionen des Hippo-Signalwegs.
Zusammenfassend zeigt diese Studie, dass die Hemmung des Hippo-Signalwegs durch Depletion von LATS1/LATS2 die Hämatopoese nicht stört. Weitere Forschung ist nötig, um die Proteinexpression, Kinaseaktivität und die Rolle unter Stressbedingungen (z. B. serielle Transplantationen) zu untersuchen. Zudem sollten gewebespezifische Knockout-Modelle genutzt werden, um die Funktionen von LATS1/LATS2 im hämatopoetischen System umfassend zu charakterisieren.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000000934