Expertenkonsens zur Vitrifikation humaner Oozyten und Embryonen

Expertenkonsens zur Vitrifikation humaner Oozyten und Embryonen

Die Kryokonservierung humaner Oozyten und Embryonen ist ein entscheidender Bestandteil assistierter Reproduktionstechnologien (ART). Die Vitrifikation, eine ultraschnelle Gefriertechnik, hat sich aufgrund ihrer Fähigkeit, strukturelle und funktionelle Integrität der Zellen zu erhalten, zur bevorzugten Methode entwickelt. Dieses Konsensusdokument zielt darauf ab, umfassende und systematische Leitlinien für den Vitrifikationsprozess bereitzustellen, um hochwertige Dienstleistungen in reproduktionsmedizinischen Zentren zu gewährleisten. Die Leitlinien basieren auf aktueller Forschung, klinischer Praxis und Expertenmeinungen und decken Aspekte wie Personalausbildung, Reagenzienauswahl, technische Verfahren, Qualitätsmanagement und Lagerungsfristen ab.

Abschnitt 1: Schulung und Qualifikation des Personals

Der Erfolg der Vitrifikation hängt maßgeblich von der Expertise der durchführenden Embryologen ab. Die Ausbildung neuer Mitarbeiter erfolgt daher durch erfahrene Embryologen, die deren Kompetenz anhand von Qualitätsmanagementindikatoren sowie dem Verständnis der Grundprinzipien der Vitrifikation bewerten. Diese Prinzipien umfassen die Kontrolle der Kryoprotektantienkonzentration, der Arbeitstemperatur und der Aufwärm-/Abkühlraten.

Das Training gliedert sich in mehrere Phasen:

1. Praxis an Mausembryonen: Anfänger üben zunächst an achtzelligen Mausembryonen, die weniger empfindlich auf Vitrifikation und Auftauen reagieren. Die Überlebensrate dieser Embryonen darf nicht unter der von humanen Tag-3-Embryonen desselben Zentrums liegen. Nach dem Auftauen werden die Mausembryonen 24–48 Stunden kultiviert, wobei die Blastozystenbildungsrate mindestens 80 % betragen muss.
2. Umgang mit verworfenen humanen Proben: Trainees gewöhnen sich an Größe, Form und Handhabung humaner Oozyten/Embryonen.
3. Supervisierte Patientenproben: Anfänger bearbeiten schrittweise bis zu 20 % der Patientenproben unter Aufsicht, um Sicherheit vor dem Umgang mit wertvollem Probenmaterial zu erlangen.

Abschnitt 2: Auswahl und Verwendung von Reagenzien und Verbrauchsmaterialien

Kommerziell erhältliche Vitrifikations- und Auftaureagenzien mit registrierter Zulassung werden dringend empfohlen. Diese müssen qualitätskontrolliert sein, einschließlich Mausembryonentests, Endotoxinprüfungen, Sterilitätstests sowie pH- und Osmolaritätsmessungen. ART-Labore sollten zwei verschiedene Reagenzienmarken vorrätig halten, um Lieferengpässe oder Chargenfehler zu kompensieren.

Kryokonservierungsträger werden in offene (direkter Flüssigstickstoffkontakt) und geschlossene Systeme unterteilt. Geschlossene Träger oder separate Dewargefäße werden für Proben infektiöser Patienten verwendet, um Kreuzkontaminationen zu minimieren.

Abschnitt 3: Vitrifikation und Auftauprozesse für Oozyten, Embryonen im Teilungsstadium und Blastozysten

Vitrifikation von Oozyten

• Vorbereitung: Reagenzien auf Raumtemperatur (24°C–26°C) bringen. Oozyten werden 38–40 Stunden nach hCG-Gabe vitrifiziert und unmittelbar zuvor denudiert. Riesenoozyten oder solche mit glatten endoplasmatischen Retikulum-Aggregaten sind ungeeignet.
• Schritte:
  1. Oozyten in Basislösung (BS) und Gleichgewichtslösung (ES) überführen (je 3 Minuten).
  2. ES unter Ölschicht inkubieren (6–9 Minuten).
  3. Rest-ES in Vitrifikationslösung (VS) entfernen (3–5 Positionen).
  4. Beladung des Trägers (45–60 Sekunden).

Vitrifikation von Teilungsstadien und Blastozysten

• Empfehlungen: Maximal zwei Embryonen pro Träger; Einzelbeladung hochqualitativer Blastozysten. Vitrifikation erfolgt bei Raumtemperatur oder 37°C.
• Schritte: Ähnlich wie bei Oozyten, mit angepassten Inkubationszeiten in ES und VS.

Auftauprozess

1. Auftaulösung (TS) auf 37°C erwärmen.
2. Embryonen/Oozyten innerhalb von 1 Sekunde aus dem Stickstoff in TS überführen (45–60 Sekunden).
3. Schrittweise Übertragung in Verdünnungs- (DS) und Basislösung (je 3–5 Minuten).
4. Zeitliche Koordination: Intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) 2–3 Stunden nach Oozytenantauen. Embryotransfer bei Blastozysten 2 Stunden post-Auftauen zur Re-Expansionskontrolle.

Abschnitt 4: Künstliche Schrumpfung von Blastozysten

Die Laser-induzierte Schrumpfung verbessert die Vitrifikationsergebnisse. Der Laser wird an der Trophektoderm-Zellverbindung fern des inneren Zellmassivs appliziert (1–2 Pulse). Die Vitrifikation erfolgt 10–15 Minuten nach Schrumpfung, um eine Re-Expansion zu verhindern.

Abschnitt 5: Assisted Hatching

• Zonapelluzida (ZP)-Verdünnung: Bei Morulae oder Teilungsstadien wird die ZP-Dicke um 50 %–80 % reduziert (25 %–50 % des Umfangs).
• ZP-Eröffnung: Bei Blastozysten der Grade 4–6 wird eine Öffnung von 25 %–50 % des ZP-Umfangs erzeugt. Für frühe Blastozysten (Grade 1–3) wird ebenfalls eine Verdünnung empfohlen.

Abschnitt 6: Qualitätsmanagement

Überlebenskriterien

• Oozyten: Intakte Zellmembran, klares Zytoplasma. Ausschluss bei Vakuolisierung oder Zytoplasmaaustritt.
• Teilungsstadien: Mindestens 50 % intakte Blastomeren.
• Blastozysten: ≥75 % intakte Zellen oder Re-Expansion innerhalb von 2 Stunden.

Leistungskennzahlen (KPIs)

Monatliche Erfassung von Überlebensraten, Blastozystenbildungsraten und Schwangerschaftsoutcomes. Abweichungen von Kompetenz- oder Benchmarkwerten (z. B. zwei Standardabweichungen unter dem Jahresdurchschnitt) erfordern Ursachenanalysen.

Abschnitt 7: Lagerungsfristen

Die empfohlene Lagerungsdauer beträgt:

• Vitrifizierte Oozyten: ≤1 Jahr.
• Embryonen: ≤5 Jahre.

Fazit

Dieser Konsensus bietet reproduktionsmedizinischen Zentren evidenzbasierte Leitlinien zur Optimierung der Vitrifikationspraxis. Durch deren Umsetzung können klinische Ergebnisse verbessert und Ressourcen effizient genutzt werden.

doi.org/10.1097/CM9.0000000000002895