Identifizierung eines neuartigen Coronavirus als Ursache schwerer Pneumonien beim Menschen: Eine deskriptive Studie
Einleitung
Coronaviren (CoVs) sind umhüllte Viren mit einem einzelsträngigen RNA-Genom positiver Polarität, das typischerweise eine Länge von 26 bis 32 Kilobasen aufweist. Sie gehören zur Unterfamilie Orthocoronavirinae innerhalb der Familie Coronaviridae und werden in vier Gattungen unterteilt: Alphacoronaviren (α), Betacoronaviren (β), Gammacoronaviren (γ) und Deltacoronaviren (δ). Das virale Genom kodiert vier strukturelle Proteine: Spike (S), Hülle (E), Membran (M) und Nukleokapsid (N), sowie mehrere nicht-strukturelle Proteine und einzigartige Akzessorproteine.
CoVs infizieren weltweit Menschen sowie verschiedene Vogel- und Säugetierarten. Sechs humanpathogene CoVs sind bekannt, darunter zwei α-CoVs (229E und NL63) und vier β-CoVs (OC43, HKU1, SARS-CoV und MERS-CoV). Alle humanen CoVs sind zoonotischen Ursprungs, wobei Fledermäuse als Hauptreservoir gelten. Seit Beginn des 21. Jahrhunderts verursachten zwei zoonotische CoVs – SARS-CoV und MERS-CoV – schwere Erkrankungen beim Menschen. Der SARS-CoV-Ausbruch 2003 führte zu 8.096 Fällen mit 774 Todesfällen weltweit, während MERS-CoV (identifiziert 2012) 2.494 Infektionen mit einer Letalitätsrate von 34,4% verursachte.
Methoden
Ethische Genehmigung
Die Studie erfolgte gemäß der Deklaration von Helsinki und wurde von der Nationalen Gesundheitskommission der Volksrepublik China sowie der Ethikkommission des Krankenhauses Wuhan Jinyintan (Nr. KY-2020-01.01) genehmigt. Aufgrund des Kontexts neu auftretender Infektionskrankheiten wurde auf eine schriftliche Einwilligung verzichtet.
Klinische Proben und Datenerhebung
Bronchoalveoläre Lavage (BAL)-Proben von fünf Patienten mit Pneumonie wurden zwischen dem 18. und 29. Dezember 2019 im Krankenhaus Wuhan Jinyintan gesammelt. Erhoben wurden klinische Daten, demografische Merkmale, Vorerkrankungen, Symptome, radiologische Befunde, Laborergebnisse, Reiseanamnese, Tierkontakte und Outcomes.
Genomsequenzierung
Nukleinsäuren wurden mit dem Direct-zol RNA Miniprep Kit und Trizol LS extrahiert. Die Sequenzierungsbibliothek wurde mittels Transposase-basierter Methodik erstellt und auf einer Illumina NextSeq-Plattform sequenziert. Qualitätskontrollen umfassten die Entfernung von Low-Complexity-Reads, Adapter-Trimming, Host- und ribosomale RNA-Abschöpfung. Taxonomische Zuordnung erfolgte mit Kraken 2 gegen Referenzdatenbanken.
Phylogenetische Analyse
Multiples Sequenzalignment wurde mit ClustalW in MEGA durchgeführt. Phylogenetische Bäume wurden mittels Maximum-Likelihood-Methode konstruiert. Vollständige Genomsequenzen wurden in der GISAID-Datenbank (Nr. EPI_ISL_402123, EPI_ISL_403928-31) und dem National Genomics Data Center hinterlegt.
Virusisolierung
BAL-Proben wurden auf Vero-Zellen inokuliert und täglich auf zytopathischen Effekt (CPE) überwacht. Virale Partikel wurden negativ mit Phosphorwolframsäure kontrastiert und elektronenmikroskopisch charakterisiert. Virale Nukleinsäuren wurden mittels RT-PCR mit spezifischen Primern bestätigt.
Immunfluoreszenzassay
Zellaufschwemmungen infizierter bzw. nicht-infizierter Zellen wurden auf Teflon-beschichteten Objektträgern fixiert. Die Färbung erfolgte mit Rekonvaleszentenserum oder Kontrollserum sowie FITC-konjugiertem Anti-Human-IgG-Antikörper.
Ergebnisse
Patientencharakteristika
Fünf Patienten (41–65 Jahre) zeigten Fieber, Husten und Dyspnoe. Drei hatten Kontakt zum Huanan-Seafood-Markt. Alle entwickelten ein akutes Atemnotsyndrom (ARDS), ein Patient verstarb. Thoraxaufnahmen wiesen diffuse Infiltrate und Konsolidierungen auf.
Identifizierung eines neuartigen β-CoV
Sequenzanalysen identifizierten einen bisher unbekannten β-CoV-Stamm mit 99,8–99,9% nukleotidischer Identität zwischen den Isolaten. Das Virus zeigt 79,0% Identität mit SARS-CoV und 51,8% mit MERS-CoV. Phylogenetisch steht es Fledermaus-SARS-ähnlichen CoVs (SL-ZC45; 87,6–87,7% Identität) am nächsten, bildet jedoch einen separaten Kladen.
Phylogenetische Merkmale
Das Virus besitzt ein intaktes ORF8-Gen – charakteristisch für fledermausstämmige CoVs. Die Rezeptorbindungsdomäne ähnelt der von SARS-CoV, was auf Nutzung desselben Rezeptors hinweist.
Viruskultur
Nach zwei Passagen zeigten 30% der Vero-Zellen CPE. Elektronenmikroskopisch wurden typische Coronaviren mit Oberflächenspikes nachgewiesen. Immunfluoreszenz bestätigte virale Partikel in infizierten Zellen.
Klinischer Verlauf
Neben ARDS traten septischer Schock und akutes Nierenversagen auf. Ein Patient verstarb, einer wurde entlassen, drei verblieben hospitalisiert.
Diskussion
Die Identifizierung eines neuartigen fledermausstämmigen CoVs mit potenziell fatalem respiratorischem Krankheitsbild unterstreicht dessen Gefährdungspotenzial für die öffentliche Gesundheit. Die Ähnlichkeit der Rezeptorbindungsdomäne zu SARS-CoV legt ACE2 als möglichen Eintrittsrezeptor nahe. Das Fehlen oberer Atemwegssymptome bei rasch progredienter Pneumonie weist auf eine besondere Organotropie hin, deren mechanistische Grundlagen weiter erforscht werden müssen.
Die Detektion subklinischer Infektionen mittels serologischer Assays ist entscheidend für die Einschätzung des epidemiologischen Potenzials. Zukünftige Studien müssen Übertragungswege, tierische Reservoire und die Virulenzdeterminanten dieses neuartigen Erregers klären, um präventive Maßnahmen zu optimieren.
Zusammenfassend unterstreicht diese Entdeckung die anhaltende Gefahr zoonotischer Coronaviren. Eine umgehende Klärung der Infektionsquelle und Übertragungsdynamik ist essenziell, um eine mögliche Epidemie zu verhindern.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000000722