Integrin β5-Untereinheit reguliert hyperglykämieinduzierte Apoptose

Integrin β5-Untereinheit reguliert hyperglykämieinduzierte Apoptose vaskulärer Endothelzellen über FoxO1-vermittelte Makroautophagie

Einleitung
Diabetes mellitus (DM) ist eine Stoffwechselstörung, die durch Insulinresistenz und Hyperglykämie charakterisiert ist und zu mikrovaskulären Komplikationen wie Retinopathie, Nephropathie und Kardiomyopathie führt. Apoptose von Endothelzellen und Akkumulation der extrazellulären Matrix (ECM) in der Basalmembran (BM) sind entscheidende Faktoren für mikrovaskuläre Dysfunktionen bei DM. Die ECM, bestehend aus Proteinen wie Fibronectin, interagiert mit Integrinen – transmembranen Rezeptoren aus α- und β-Untereinheiten – um Zellüberleben, Differenzierung und Stoffwechsel zu regulieren. Unter diabetischen Bedingungen sind Fibronectin und Integrine in der Gefäßwand hochreguliert, ihre Rolle bei hyperglykämieinduzierter Endothelapoptose bleibt jedoch unklar. Diese Studie untersucht die Funktion von Integrin β5 (ITGB5) und seinem Liganden Fibronectin bei Endothelapoptose und Autophagie unter Hochglukosebedingungen.

Experimentelle Modelle und Methoden
In-vivo-Modelle: Spontan diabetische db/db-Mäuse (Leptinrezeptor-Knockout) und nicht-diabetische db/m-Mäuse wurden verwendet. Endothelspezifischer ITGB5-Knockdown wurde durch Schwanzveneninjektion von Adenovirus-assoziierten Viren (AAV) mit Kurzhairpin-RNA (shRNA) unter dem TIE2-Promotor erreicht. Nach 4 Wochen wurden myokardiale Endothelzellen mittels CD31-Mikrobeads isoliert und Proteine analysiert.

In-vitro-Modelle: Humane Nabelvenenendothelzellen (HUVECs) wurden in Normal- (5 mmol/L) oder Hochglukosemedium (33 mmol/L) kultiviert. siRNA-Transfektion zielte auf ITGB5, ITGAV (Integrin αv) oder Fibronectin. Apoptose wurde mittels TUNEL-Assay bewertet, der Autophagieflux mit GFP-mRFP-LC3-Lentivirus überwacht.

Protein- und RNA-Analysen: Western Blot quantifizierte cleaved Caspase-3, Bax, Bcl-2, LC3, Beclin1, Atg7 und FoxO1. Die nukleäre Translokation von FoxO1 wurde mittels Immunfluoreszenz analysiert. RNA-Sequenzierung (RNA-seq) und KEGG-Pfadanalyse identifizierten ITGB5-Zielwege.

Hauptbefunde

1. Hyperglykämie induziert Hochregulation von Fibronectin und ITGB5 in Endothelzellen

   • In Vivo: Diabetische db/db-Mäuse zeigten erhöhte Fibronectin-, ITGAV- und ITGB5-Expression in myokardialen Endothelzellen im Vergleich zu db/m-Kontrollen. ITGB5-Knockdown reduzierte Autophagiemarker (LC3-II, Beclin1) und Apoptose.
   • In Vitro: Hochglukose steigerte Fibronectin-mRNA und -Protein innerhalb von 6 Stunden, während ITGB5 erst nach 24 Stunden anstieg. Immunfluoreszenz bestätigte die Kolokalisation von Fibronectin und αvβ5 (Pearson’s R = 0,72).

2. ITGB5 vermittelt Hochglukose-induzierte Apoptose

   • ITGB5-Silencing (nicht ITGAV) in HUVECs reduzierte cleaved Caspase-3 (um 45 %, P <0,01) und das Bax/Bcl-2-Verhältnis (um 50 %, P <0,001) unter Hochglukose. TUNEL-Färbung zeigte eine 30 %ige Apoptosereduktion (P <0,01).
   • Exogenes Fibronectin (5 µg/mL) imitierte Hochglukose-induzierte Apoptose, die durch ITGB5-siRNA blockiert wurde.

3. ITGB5 aktiviert FoxO1-abhängige Autophagie

   • RNA-seq identifizierte den AGE-RAGE-Signalweg und FoxO1 als Schlüsselzielmoleküle. Hochglukose erhöhte die nukleäre FoxO1-Translokation (2,5-fach, P <0,001), die durch ITGB5-Knockdown supprimiert wurde.
   • FoxO1-Überexpression hob die protektiven Effekte von ITGB5-siRNA auf, was in einer Reaktivierung von Caspase-3 und Autophagieflux (LC3-II-Degradation) resultierte.
   • Chloroquin (50 µmol/L), ein Autophagiehemmer, reduzierte LC3-II-Akkumulation (40 %, P <0,01) und Apoptose in ITGB5-defizienten Zellen.

4. Autophagie fördert Endothelapoptose unter Hyperglykämie

   • Hochglukose erhöhte Beclin1 (1,8-fach, P <0,01) und LC3-II (2,2-fach, P <0,001), was exzessive Autophagie anzeigt. Beclin1-siRNA reduzierte Apoptose um 35 % (P <0,01).
   • FoxO1-Knockdown normalisierte Beclin1- und LC3-II-Spiegel, bestätigend, dass FoxO1 die Autophagieregulation steuert.

Diskussion
Die Studie identifiziert ITGB5 als zentralen Mediator hyperglykämieinduzierter Endothelapoptose. Schlüsselmechanismen umfassen:

• Fibronectin-ITGB5-Interaktion: Hochglukose aktiviert eine pro-apoptotische Signalachse über Fibronectin/ITGB5.
• FoxO1-Aktivierung: ITGB5 induziert nukleäre FoxO1-Translokation, die die Transkription von Autophagiegenen (Beclin1, LC3) antreibt.
• Dysregulierte Autophagie: Übermäßige Autophagie unter Hochglukose überlastet zelluläre Clearance-Mechanismen und aktiviert Caspase-3-abhängige Apoptose.

Endothelspezifischer ITGB5-Knockdown verbesserte die Kapillardichte (25 % Zunahme, P <0,01) und reduzierte TUNEL-positive Zellen (40 %, P <0,001) in db/db-Mäusen, was therapeutisches Potenzial verdeutlicht.

Klinische Implikationen
Eine gezielte Hemmung von ITGB5 oder FoxO1 könnte diabetische mikrovaskuläre Komplikationen abschwächen. Zukünftige Studien sollten ITGB5-Inhibitoren oder FoxO1-Modulatoren in präklinischen Modellen evaluieren.

doi.org/10.1097/CM9.0000000000002769