Kryokonservierung von Stuhlproben zu Hause: Eine effektive Strategie für Längsschnittstudien unter Verwendung von Multi-Omics-Ansätzen
Das menschliche Darmmikrobiom spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gesundheit und der Beeinflussung von Krankheitsverläufen. Die dynamischen Wechselwirkungen zwischen Darmmikroben und ihrem Wirt sind komplex, was es schwierig macht, einzelne mikrobielle Stämme oder Signaturen als zuverlässige Marker für die Vorhersage von Krankheitsrisiken oder die Bewertung von Ergebnissen zu verwenden. Um diese Wechselwirkungen besser zu verstehen, sind Multi-Omics-Ansätze zu unverzichtbaren Werkzeugen für die Analyse der Darmmikroumgebung geworden. Längsschnittstudien, die häufige Stuhlprobenentnahmen erfordern, stehen jedoch vor erheblichen Herausforderungen, insbesondere bei der Lagerung, dem Transport und der Handhabung der Proben. Diese Studie untersucht die Machbarkeit der Kryokonservierung von Stuhlproben zu Hause bei -20°C für bis zu einen Monat im Vergleich zur Standardpraxis der sofortigen Lagerung bei -80°C, um festzustellen, ob diese Methode die Darmmikroumgebung für die Multi-Omics-Analyse effektiv erhalten kann.
Hintergrund und Begründung
Die Darmmikroumgebung ist hochdynamisch, wobei innerhalb kurzer Zeiträume erhebliche Veränderungen auftreten, insbesondere während akuter Phasen von Krankheiten wie entzündlichen Darmerkrankungen (IBD). Um diese Veränderungen zu erfassen, ist eine häufige Probenentnahme – alle 2 bis 3 Tage – erforderlich. Die mikrobielle Zusammensetzung von Stuhlproben, die bei Raumtemperatur für mehr als 24 Stunden gelagert werden, verändert sich jedoch signifikant, was eine sofortige Kryokonservierung kritisch macht. Während die Lagerung bei -80°C der Goldstandard ist, ist sie für zu Hause durchgeführte Längsschnittstudien oft unpraktisch. Ein alternativer Ansatz ist die Lagerung bei -20°C, die für die Teilnehmer zugänglicher ist. Diese Studie zielte darauf ab, zu bewerten, ob Stuhlproben, die bei -20°C für bis zu einen Monat gelagert werden, die Integrität der Darmmikroumgebung für die Multi-Omics-Analyse, einschließlich der mikrobiellen, pilzlichen und Gallensäure (BA)-Profilerstellung, aufrechterhalten können.
Studiendesign und Methodik
Stuhlproben wurden alle drei Tage von drei gesunden Freiwilligen über einen Zeitraum von einem Monat gesammelt. Jede Probe wurde in zwei sterile Behälter mit Stabilisierungspuffer aufgeteilt und entweder bei -80°C oder -20°C innerhalb einer Stunde nach der Entnahme gelagert. Insgesamt wurden 60 Proben für die Sequenzierung des 16S rRNA-Gens und der internen transkribierten Spacer 1 (ITS1)-Region gesammelt, und 24 Proben wurden für die BA-Analyse gesammelt. Obwohl die meisten Proben in dreitägigen Intervallen gesammelt wurden, gab es bei acht Proben eine Verzögerung von mehr als einem Tag. Die Qualität der pilzlichen RNA war bei 24 der 60 Proben niedrig, was auf die Instabilität der pilzlichen DNA während der Kryokonservierung zurückgeführt wurde.
Analyse der mikrobiellen und pilzlichen Gemeinschaften
Die Studie identifizierte insgesamt 140 bakterielle Gattungen in allen Proben, mit einem Median von 74 Gattungen pro Probe. Die 20 häufigsten Gattungen repräsentierten 74% bis 95% der gesamten mikrobiellen Gemeinschaft. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der Gesamtzahl der mikrobiellen Gattungen oder in den dominanten Gattungen zwischen den bei -80°C und -20°C gelagerten Proben beobachtet. Es wurden jedoch Schwankungen in der Anzahl der mikrobiellen Gattungen über kurze Zeiträume innerhalb von Individuen beobachtet, selbst bei denen mit stabilen Ernährungsgewohnheiten.
Alpha- und Beta-Diversitätsanalysen wurden durchgeführt, um zeitliche Veränderungen der mikrobiellen Diversität innerhalb von Individuen und zwischen den Lagerungstemperaturen zu bewerten. Die Alpha-Diversität, gemessen anhand der Shannon- und Simpson-Indizes, zeigte, dass die mikrobielle Diversität zwischen den Individuen variierte, aber nicht signifikant von der Lagerungstemperatur oder der Zeit beeinflusst wurde. Die Hauptkomponentenanalyse basierend auf Bray-Curtis-Distanzen ergab, dass individuelle Unterschiede den größten Teil der Varianz in der mikrobiellen Zusammensetzung ausmachten (R2 = 0,68), während die Varianz aufgrund von zeitlichen Verschiebungen in der Probenentnahme (R2 = 0,03) höher war als die zwischen den Lagerungstemperaturen (R2 < 0,01). Zeitliche Veränderungen in den mikrobiellen Gemeinschaften innerhalb von Individuen waren signifikant, aber diese Veränderungen waren im Vergleich zu interindividuellen Unterschieden gering.
Die Studie bewertete auch die Stabilität der pilzlichen Gemeinschaften. Insgesamt wurden 106 pilzliche Gattungen identifiziert, mit einem Median von 11,5 Gattungen pro Probe. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der Gesamtzahl der pilzlichen Gattungen zwischen den Lagerungstemperaturen beobachtet. Zeitliche Veränderungen in der pilzlichen Diversität innerhalb von Individuen waren jedoch ausgeprägter als die bei Bakterien beobachteten. Die dominanten pilzlichen Gattungen umfassten Saccharomyces, Kazachstania, Aspergillus, Cortinarius und Hygrophorus, wobei Saccharomyces in den meisten Proben am häufigsten vorkam. Die Häufigkeit dieser Gattungen variierte im Laufe der Zeit signifikant, was die Instabilität der Mykobiota als Reaktion auf Ernährungsänderungen und zeitliche mukosale Immunreaktionen widerspiegelt.
Gallensäure-Profilerstellung
Zielgerichtete Metabolomik wurde an 24 Proben durchgeführt, um die Auswirkungen der Lagerungsbedingungen auf fäkale BAs zu bewerten. Insgesamt wurden 49 BAs identifiziert, wobei primäre BAs (z. B. Chenodesoxycholsäure) und sekundäre BAs (z. B. Desoxycholsäure, Isolithocholsäure, Lithocholsäure und Ursodesoxycholsäure) 45% bis 88% aller BAs ausmachten. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in den Gesamtspiegeln der BAs zwischen den bei -80°C und -20°C gelagerten Proben beobachtet. Die Spiegel spezifischer BAs, einschließlich Nutriacholsäure, Alpha-Muricholsäure (MCA), Beta-MCA und 3-Beta-Desoxycholsäure, nahmen jedoch während der Langzeitlagerung bei -20°C im Vergleich zur Goldstandardmethode ab. Darüber hinaus waren die Spiegel mehrerer BAs, wie Hyocholsäure, Glykocholsäure, Taurolithocholsäure 3-Sulfat und Ketolithocholsäure, bei -20°C auch in Proben, die für kurze Zeit gelagert wurden, reduziert.
Erweiterte lokale Ähnlichkeitsanalyse (eLSA)
Um dynamische Schwankungen in der Häufigkeit bakterieller Gattungen während der Lagerung zu bewerten, wurde eine erweiterte lokale Ähnlichkeitsanalyse (eLSA) durchgeführt. Diese Technik wird häufig in der Zeitreihenanalyse verwendet, um zeitliche Muster des Auftretens mikrobieller Arten zu identifizieren. Die Ergebnisse zeigten, dass die Veränderungen in den häufigsten mikrobiellen Gattungen für verschiedene Lagerungstemperaturen ähnlich waren. Mehrere dominante Gattungen in den Phyla Bacteroidetes und Firmicutes, einschließlich Bacteroides, Prevotella_9, Faecalibacterium und Blautia, zeigten jedoch schlechte lokale Assoziationen, was darauf hindeutet, dass ihre Häufigkeit durch die Lagerung bei -20°C beeinträchtigt worden sein könnte.
Diskussion
Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die Kryokonservierung von Stuhlproben zu Hause bei -20°C für bis zu einen Monat eine praktikable Strategie für Längsschnittstudien unter Verwendung von Multi-Omics-Ansätzen ist. Die mikrobiellen und pilzlichen Gemeinschaften sowie die BA-Profile wurden bei dieser Temperatur weitgehend erhalten, wobei keine signifikanten Unterschiede zu den bei -80°C gelagerten Proben beobachtet wurden. Die Studie zeigte jedoch auch die Instabilität der pilzlichen DNA und die potenzielle Degradation spezifischer BAs während der Langzeitlagerung bei -20°C auf. Diese Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit alternativer, praktischer und zuverlässiger Strategien für die Konservierung von Stuhlproben, um potenzielle Verzerrungen in der Mikrobiomanalyse zu reduzieren.
Die Studie zeigte auch signifikante zeitliche Veränderungen in den mikrobiellen und pilzlichen Gemeinschaften innerhalb von Individuen auf, was die dynamische Natur der Darmmikroumgebung unterstreicht. Während interindividuelle Unterschiede den größten Teil der Varianz in der mikrobiellen Zusammensetzung ausmachten, waren Schwankungen, die auf Ernährungsfaktoren und mukosale Immunreaktionen zurückzuführen waren, relativ gering. Die dominante Darmmikrobiota auf Gattungsebene blieb im Laufe der Zeit und zwischen verschiedenen Lagerungstemperaturen stabil, obwohl drastische Veränderungen in der relativen Häufigkeit dominanter Gattungen beobachtet wurden.
Schlussfolgerung
Die Kryokonservierung von Stuhlproben zu Hause bei -20°C bietet eine praktische Lösung für Längsschnittstudien, die häufige Probenentnahmen erfordern. Diese Methode erhält die Darmmikroumgebung effektiv für die Multi-Omics-Analyse und macht sie für Teilnehmer zugänglich, ohne die Integrität der Proben zu beeinträchtigen. Die Instabilität der pilzlichen DNA und die Degradation spezifischer BAs während der Langzeitlagerung bei -20°C unterstreichen jedoch die Notwendigkeit weiterer Forschung, um die Techniken zur Probenkonservierung zu optimieren. Durch die Bewältigung dieser Herausforderungen können Forscher die Zuverlässigkeit von Längsschnittstudien verbessern und tiefere Einblicke in die komplexen Wechselwirkungen zwischen dem Darmmikrobiom und der Wirtsgesundheit gewinnen.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000002106