Lange nicht-kodierende RNA HOTAIRM1 fördert die Proliferation und hemmt die Apoptose von Gliomzellen durch Regulation der miR-873-5p/ZEB2-Achse

Glioblastome, die aggressivste Form von Gliomen, sind maligne Hirntumoren mit schlechter Prognose und hoher Mortalitätsrate. Trotz Fortschritten in klinischen Behandlungen wie chirurgischer Resektion, Strahlentherapie und Chemotherapie bleibt die Rezidivrate hoch, und Arzneimittelresistenz sowie Therapienebenwirkungen persistieren. Daher ist das Verständnis der molekularen Mechanismen, die der Entstehung und Progression von Glioblastomen zugrunde liegen, entscheidend für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien. Aktuelle Forschungen heben die Rolle nicht-kodierender RNAs, einschließlich Mikro-RNAs (miRNAs) und langer nicht-kodierender RNAs (lncRNAs), bei der Regulation der Genexpression und der Beeinflussung des Krebsfortschritts hervor. Diese Studie untersucht die Rolle von miR-873-5p im Glioblastom und erforscht die regulatorische Achse unter Einbeziehung der lncRNA HOTAIRM1 und des Transkriptionsfaktors ZEB2.

Hintergrund und Bedeutung

Gliome machen 80 % der primären malignen Hirntumoren aus, wobei Glioblastome (Grad-IV-Gliome) die aggressivsten und häufigsten sind. Aktuelle Therapien sind aufgrund der invasiven Natur des Tumors und seiner Therapieresistenz unzureichend. Nicht-kodierende RNAs, insbesondere miRNAs und lncRNAs, haben sich als kritische Regulatoren der Genexpression in Krebserkrankungen erwiesen. MiRNAs, kleine nicht-kodierende RNAs mit 18–25 Nukleotiden, regulieren die Genexpression durch Bindung an komplementäre Stellen in den 3′-untranslatierten Regionen (UTRs) von Ziel-mRNAs, was zu deren Degradation oder Translationshemmung führt. LncRNAs können hingegen als konkurrierende endogene RNAs (ceRNAs) wirken, die miRNAs „abfangen“ und deren Bindung an Ziel-mRNAs verhindern, wodurch sie die Genexpression modulieren.

Der Transkriptionsfaktor ZEB2 ist bekannt für die Förderung der epithelial-mesenchymalen Transition (EMT), einem Prozess, der mit Krebsmetastasierung und -progression assoziiert ist. Im Glioblastom wurde ZEB2 mit Zellproliferation, Migration und Apoptose in Verbindung gebracht. Diese Studie zielt darauf ab, die Rolle von miR-873-5p im Glioblastom und dessen Interaktion mit HOTAIRM1 und ZEB2 aufzuklären, um Einblicke in die molekularen Mechanismen der Glioblastomprogression zu gewähren.

Methoden

Klinische Proben und Zellkultur

Es wurden 20 Glioblastomgewebeproben und 10 normale Hirngewebeproben aus der Zhejiang Tongde Hospital analysiert. Normale Gewebe stammten aus angrenzenden nicht-tumoralen Regionen von Glioblastompatienten. Die Glioblastomzelllinien U87, LN-229, U-251 und A172 sowie normale humane Astrozyten (HA) wurden in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fötalem Rinderserum und Antibiotika kultiviert.

RNA-Extraktion und quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR)

Gesamt-RNA wurde mittels TRIzol-Reagenz extrahiert. cDNA wurde mit einem High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit synthetisiert, und qRT-PCR wurde durchgeführt, um die Expression von miR-873-5p, ZEB2 und HOTAIRM1 zu messen. GAPDH und U6 dienten als endogene Kontrollen für mRNA- bzw. miRNA-Expression.

Zelltransfektion und Funktionsassays

MiR-873-5p-Mimics, Inhibitoren und Mock-Kontrollen wurden mittels Lipofectamine 2000 in U87-Zellen transfiziert. Die Effekte auf Proliferation, Migration und Apoptose wurden mittels CCK-8-Assay, Wundheilungsassay und Durchflusszytometrie analysiert. Die Expression von ZEB2 und HOTAIRM1 wurde durch pcDNA-Vektoren und shRNA-Konstrukte moduliert.

Luciferase-Reporterassay und RNA-Immunpräzipitation (RIP)

Die Interaktion zwischen miR-873-5p und der 3′-UTR von ZEB2 oder HOTAIRM1 wurde mittels Luciferase-Reporterassays untersucht. RIP bestätigte die Bindung von HOTAIRM1 und miR-873-5p an Argonaute 2 (Ago2), eine Schlüsselkomponente des RNA-induzierten Silencing-Komplexes (RISC).

Western Blot

Proteinlevel von ZEB2, Cyclin A1, Cyclin D1, Bcl-2 und aktiviertem Caspase-3 wurden mittels Western Blot analysiert. Zelllysate wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf PVDF-Membranen transferiert. Spezifische Primärantikörper wurden verwendet, und Tubulin oder GAPDH dienten als Ladungskontrollen.

Statistische Analyse

Daten wurden mit GraphPad Prism analysiert. Gruppenunterschiede wurden mittels Student-t-Test oder Kruskal-Wallis-Test bewertet. Ein p-Wert <0,05 galt als signifikant.

Ergebnisse

MiR-873-5p ist im Glioblastom herunterreguliert

Die Analyse des GEO-Datensatzes GSE103228 zeigte eine signifikante Herunterregulation von miR-873-5p in Glioblastomgeweben im Vergleich zu Normalgeweben. Dies wurde in klinischen Proben bestätigt (Glioblastom: 0,378 ± 0,114 vs. Normal: 0,762 ± 0,231). Ebenso war miR-873-5p in Glioblastomzelllinien reduziert, mit der niedrigsten Expression in U87-Zellen.

MiR-873-5p hemmt Proliferation und Migration und fördert Apoptose

Überexpression von miR-873-5p in U87-Zellen hemmte Proliferation und Migration signifikant und induzierte Apoptose. Die Inhibition von miR-873-5p hatte entgegengesetzte Effekte. Dies deutet auf eine tumorsuppressive Rolle von miR-873-5p hin.

ZEB2 ist ein Ziel von miR-873-5p

Bioinformatische Analysen identifizierten ZEB2 als Ziel von miR-873-5p. Luciferase-Assays bestätigten die Bindung von miR-873-5p an die 3′-UTR von ZEB2. Die Überexpression von miR-873-5p reduzierte ZEB2, während dessen Inhibition ZEB2 erhöhte. Die Reexpression von ZEB2 in miR-873-5p-überexprimierenden Zellen kehrte die Effekte um, was auf eine Vermittlerrolle von ZEB2 hinweist.

HOTAIRM1 fördert die Glioblastomprogression

Die lncRNA HOTAIRM1 war im Glioblastom hochreguliert und negativ mit dem Patientenüberleben korreliert. HOTAIRM1-Überexpression steigerte ZEB2, förderte Proliferation/Migration und hemmte Apoptose. Der Knockdown von HOTAIRM1 reduzierte ZEB2 und unterdrückte die Tumorprogression. Diese Effekte wurden durch miR-873-5p-Inhibition aufgehoben, was auf eine ceRNA-Funktion von HOTAIRM1 hindeutet.

HOTAIRM1 spongiert miR-873-5p zur Aktivierung von ZEB2

Luciferase-Assays und RIP bestätigten die direkte Interaktion zwischen HOTAIRM1 und miR-873-5p. HOTAIRM1-Überexpression reduzierte miR-873-5p und erhöhte ZEB2, während der Knockdown umgekehrte Effekte zeigte. Dies belegt, dass HOTAIRM1 ZEB2 durch Sequestrierung von miR-873-5p aktiviert.

Diskussion

Diese Studie identifiziert eine neuartige regulatorische Achse aus HOTAIRM1, miR-873-5p und ZEB2 im Glioblastom. MiR-873-5p wirkt als Tumorsuppressor durch Hemmung von ZEB2, während HOTAIRM1 als Onkogen fungiert, indem es miR-873-5p spongiert und ZEB2 aktiviert. Diese Erkenntnisse unterstreichen die therapeutische Relevanz dieser Achse.

Die Rolle von miR-873-5p variiert kontextabhängig: Während es im Lungenkrebs progressionfördernd wirkt, hemmt es im Kolonkarzinom die TUSC3/AKT-Stoffwechselachse. Im Glioblastom unterdrückt miR-873-5p die Tumorprogression durch ZEB2-Inhibition.

HOTAIRM1 zeigt ebenfalls kontextspezifische Effekte: Im kolorektalen Karzinom wirkt es tumorsuppressiv, im Magenkarzinom hemmt es die Progression über die miR-17-5p/PTEN-Achse. Im Glioblastom fördert HOTAIRM1 hingegen die Progression durch miR-873-5p/ZEB2-Regulation.

Die Hemmung von HOTAIRM1 oder die Restauration von miR-873-5p könnte eine vielversprechende Therapiestrategie darstellen. Weitere Studien müssen das therapeutische Potenzial dieser Achse validieren.

Fazit

Diese Studie enthüllt eine neuartige regulatorische Achse aus HOTAIRM1, miR-873-5p und ZEB2 in der Glioblastomprogression. MiR-873-5p wirkt tumorsuppressiv durch ZEB2-Hemmung, während HOTAIRM1 als Onkogen die miR-873-5p-Aktivität reduziert und ZEB2 aktiviert. Diese Erkenntnisse bieten neue Ansatzpunkte für gezielte Therapien gegen Glioblastome. Zukünftige Forschungen sollten sich auf die Modulation dieser Achse konzentrieren.

doi.org/10.1097/CM9.0000000000000615