Lipopolysaccharid-induzierte intestinale Epithelschädigung: Ein neuartiges Organoid-basiertes Modell für Sepsis in vitro
Sepsis ist ein komplexes und dynamisches Syndrom mit erheblicher Heterogenität zwischen Patienten. Im Jahr 2017 wurden schätzungsweise 11,0 Millionen sepsisbedingte Todesfälle gemeldet, was 19,7 % der globalen Todesfälle entspricht. Der Darm spielt eine zentrale Rolle in der pathophysiologischen Sequenz von Ereignissen, die bei Sepsis zu einer multiplen Organfunktionsstörung führen. Trotz Fortschritte in der Behandlung liegt die Krankenhausmortalität von Patienten mit Sepsis und akuter gastrointestinaler Schädigung (AGI) weiterhin bei etwa 21,9 %. Daher sind neuartige Bewertungsparameter und effektive Therapieziele erforderlich, um die klinischen Ergebnisse zu verbessern.
Die Darmbarriere, die hauptsächlich aus Krypten und Villi des intestinalen Epithels besteht, wird bei Sepsis geschädigt, was zur Produktion von Endotoxinen und bakterieller Translokation führt. Fortschritte in der Organoid-Kulturtechnologie haben ein besseres Verständnis der Krankheitspathogenese ermöglicht und die Modellierung verschiedener Erkrankungen in vitro vorangetrieben. Intestinale Organoide sind dreidimensionale (3D), selbstorganisierende Epithelstrukturen in vitro, die aus intestinalen Stammzellen und differenzierten Epithelzellen wie enteroendokrinen Zellen, Paneth-Zellen, Tuft-Zellen und M-Zellen bestehen. Organoide behalten die Charakteristika und physiologischen Eigenschaften des Darmepithels bei und können über ein Jahr kultiviert werden, während sie genetisch stabil bleiben.
Lipopolysaccharid (LPS), das klassische Endotoxin aus der Membran gramnegativer Bakterien, wird häufig verwendet, um die akute Entzündungsreaktion bei Sepsis in vivo und in vitro zu modellieren. Bisher existieren jedoch nur wenige Ansätze für LPS-Kokulturen zur Nachahmung pathogener bakterieller Infektionen. Diese Studie zielte darauf ab, verschiedene Zeitpunkte und Konzentrationen von LPS zu untersuchen, um ein geeignetes in-vitro-Organoidmodell für sepsisbedingte intestinale Schädigungen zu etablieren.
Methoden
Tiere
Die Tierstudienprotokolle wurden von der Tierpolitik- und Tierschutzkommission des Ruijin-Krankenhauses der Medizinischen Fakultät der Shanghai Jiao Tong University genehmigt. Männliche C57BL/6-Mäuse (18–22 g) wurden vom Shanghai SLAC Laboratory Animal Centre bezogen und unter spezifisch pathogenfreien Bedingungen gehalten.
Isolation von Krypten und 3D-Organoidkultur
Primäre Dünndarmkrypten wurden von 8–10 Wochen alten C57BL/6J-Mäusen isoliert. Die Krypten wurden in Matrigel resuspendiert und in einem 37 °C warmen, 5 % CO₂-haltigen Inkubator kultiviert. Die Organoide wurden alle 7–10 Tage passagiert.
LPS-Behandlung
Für In-vivo-Experimente erhielten C57BL/6J-Mäuse 10 mg/kg LPS 12, 24 und 48 Stunden vor der Untersuchung. Für In-vitro-Experimente wurde LPS direkt zum flüssigen Medium der Organoide hinzugefügt. Die Organoide wurden 8 und 24 Stunden mit LPS-Konzentrationen von 0–400 mg/ml behandelt.
Bewertung der intestinalen Epithelschädigung
Die Bewertung umfasste Wachstumshemmung, Beeinträchtigung der Barrierefunktion, erhöhte Entzündungsreaktionen und gesteigerte Produktion antimikrobieller Peptide.
Quantitative Echtzeit-PCR (qPCR)
Die RNA-Extraktion erfolgte mit dem TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit. Die qPCR wurde mit dem SYBR Premix Ex Taq Kit und einem ABI 7500-System durchgeführt.
Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE)
Dünndarmgewebe wurde mit 4 % Paraformaldehyd inflatiert, in Paraffin eingebettet, geschnitten und HE-gefärbt.
Immunhistochemie
Gewebeschnitte wurden mit Antikörpern gegen Zonula Occludens-1 (ZO-1), Occludin und Claudin-1 inkubiert. Die Immunreaktionen wurden mittels 3,3′-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid-Lösung sichtbar gemacht.
Immunfluoreszenz
Organoide wurden mit Occludin-, ZO-1-, Claudin-1- oder Ki-67-Antikörpern markiert. Hochauflösende 3D-Bilder wurden mit dem Opera Phenix™-System erfasst.
ELISA
Die Proteinspiegel von TNF-α und GM-CSF im Kulturüberstand wurden mittels spezifischer ELISA-Kits bestimmt.
Statistische Analyse
Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt und mit Student-t-Tests verglichen. Ein p-Wert < 0,05 galt als signifikant.
Ergebnisse
Organoidwachstumshemmung durch hohe LPS-Konzentrationen
Organoide zeigten einen typischen Darmphänotyp mit Krypten-Villi-Struktur. Eine Wachstumshemmung trat bei LPS-Konzentrationen ≥150 mg/ml auf.
LPS-induzierte epitheliale Schädigung in vitro
Die Expression der Tight-Junction-Marker ZO-1, Occludin und Claudin-1 nahm nach LPS-Exposition signifikant ab. Bei LPS >100 mg/ml über 24 Stunden zeigten die Fluoreszenzintensitäten von ZO-1 und Occludin signifikante Unterschiede zur Kontrolle.
LPS-stimulierte Entzündungsreaktion
Nach 8-stündiger LPS-Stimulation stieg die RNA-Expression von IL-1α, TNF-α, GM-CSF, IL-6, Reg3α, Reg3β und Reg3γ signifikant an. Nach 24 Stunden stieg die Expression von TNF-α und IL-10 an.
LPS-induzierte intestinale Schädigung in vivo
LPS-behandelte Mäuse zeigten nach 12–24 Stunden Villusatrophie, Kryptenverlust und zelluläre Infiltration der Lamina propria. Nach 48 Stunden erholte sich das Gewebe. Die Proteinspiegel von ZO-1, Occludin und Claudin-1 sanken signifikant.
Diskussion
Diese Studie etabliert ein primäres in-vitro-System zur Untersuchung von LPS-induzierten intestinalen Schädigungen bei Sepsis. Das In-vivo-Modell zeigte eine hohe Übereinstimmung mit dem Organoid-basierten In-vitro-Modell hinsichtlich Wachstumshemmung, Barrieredefekten und Entzündungsaktivierung.
Vorteile des Organoid-Modells sind: 1) Systematische Evaluation biologischer Merkmale, 2) Einbeziehung antimikrobieller Peptide und 3) Eine verbesserte Hochdurchsatz-Immunfluoreszenzmethode für 3D-Organoide in 96-Well-Platten.
Zusammenfassend bietet dieses Modell eine Plattform zur Erforschung sepsisbedingter epithelialer Schädigungsmechanismen und zur Wirkstoffentwicklung.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000002348