Mikropillen-strukturierte Oberflächen fördern die TGF-β1-induzierte epithelial-mesenchymale Transition über FAK-Signalwege in A549-Zellen
Substratsteifigkeit und -topographie sind entscheidende biomechanische Faktoren, die das biologische Verhalten von Krebszellen, einschließlich der epithelial-mesenchymalen Transition (EMT), beeinflussen. Bei der EMT verlieren epitheliale Zellen ihre Polarität und Zell-Zell-Adhäsion und erwerben migratorische und invasive Eigenschaften mesenchymaler Zellen. Dieser Prozess spielt eine zentrale Rolle in der Krebsprogression, Metastasierung und Fibrose. Obwohl neuere Studien beginnen, den Einfluss des mechanischen Mikromilieus auf die Zelldifferenzierung zu untersuchen, bleiben die genauen Mechanismen der mechanosensitiven Signalübertragung während der EMT unklar.
Mechanische Matrixsignale regulieren nachweislich EMT-Prozesse im Zusammenhang mit Krankheitsentwicklungen. Experimente mit Polyacrylamid-Hydrogelen zeigten, dass die Substratsteifigkeit die EMT beeinflusst. Die Schlüsselfrage ist, wie Zellen mechanische Signale in biologische Signale umwandeln. Diese Umwandlung wird hauptsächlich durch das Zytoskelett vermittelt, wobei der fokale Adhäsionskomplex als Brücke zwischen Zytoskelett und Substrat fungiert. Die Fokale Adhäsionskinase (FAK) spielt hierbei eine zentrale Rolle in der Signaltransduktion und aktiviert diverse nachgeschaltete Signalwege. FAK-assoziierte Pfade sind ebenfalls an der EMT beteiligt.
Frühere Studien zeigten, dass Substrattopographie Zellmorphologie verändern kann, doch die zugrundeliegenden Signale blieben unklar. Obwohl bekannt ist, dass Topographie und Steifigkeit synergistisch die EMT induzieren – möglicherweise über den PI3K/Akt-Signalweg –, war ungeklärt, ob isolierte topographische Veränderungen allein die EMT beeinflussen.
Um den Einfluss der Topographie auf A549-Zellen (humanes Adenokarzinom) zu untersuchen, wurden PDMS-basierte Mikropillen-Arrays mit variierenden Durchmessern (10 mm) und Höhen (2–7 mm) hergestellt. A549-Zellen zeigten auf planaren Substraten und Substraten mit 2 mm hohen Mikropillen eine runde, multidirektionale Morphologie. Auf Substraten mit 4 mm oder 7 mm hohen Mikropillen wurden die Zellen fusiform und breiteten sich lateral aus.
Die Auswirkung des Mikropillenabstands auf das Zytoskelett und fokale Adhäsionen wurde mittels Immunfluoreszenz analysiert. Die Vinculin-Expression stieg mit größerem Mikropillenabstand an, was auf verstärkte Adhäsionsbildung hindeutet. Gleichzeitig nahm die Zytoskelett-Depolymerisation zu, was eine erhöhte Migrationsneigung der Zellen bei größerem Abstand nahelegt.
Der Einfluss des Mikropillenabstands auf EMT-Marker wurde ebenfalls untersucht. Ohne TGF-β1-Zugabe nahm die Expression des epithelialen Markers E-Cadherin (E-CAD) mit größerem Abstand ab, während der mesenchymale Marker Vimentin (VIM) signifikant anstieg. Dieser Prozess wurde durch die Phosphorylierung von SMAD3 und FAK verstärkt, was auf eine Beteiligung sowohl des TGF-β1-Signalwegs als auch der FAK-Aktivierung hindeutet.
Um die Rolle von FAK zu klären, wurde FAK in A549-Zellen mittels lentiviraler shRNA stummgeschaltet. In FAK-defizienten Zellen stieg die E-CAD-Expression an, während VIM abnahm, was FAK als Schlüsselmediator der topographieinduzierten EMT identifiziert.
Zusammenfassend induzieren Mikropillen-Arrays in A549-Zellen EMT-ähnliche Verhaltensänderungen in Abhängigkeit vom Mikropillenabstand. Die Expression von Adhäsions- und Zytoskelettproteinen variierte ebenfalls mit dem Abstand. Zudem beeinflusste der Mikropillenabstand die TGF-β1-induzierte EMT über die Phosphorylierung von SMAD3 und FAK. Diese Erkenntnisse unterstreichen die Rolle der Substrattopographie in der EMT-Regulation und bieten neue Ansätze für die Therapie pulmonaler Fibrose.
Die Studie wurde von 2016 bis 2019 im Hauptlabor für Biorheologische Wissenschaft und Technologie der Hochschule für Bioingenieurwesen der Universität Chongqing durchgeführt. Die Finanzierung erfolgte durch die Nationale Naturwissenschaftliche Stiftung Chinas, die Chongqing Graduate Scientific Research and Innovation Foundation und die Fundamental Research Funds for the Central Universities.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000001139