Paired Box 5 erhöht die Chemosensitivität von Plattenepithelkarzinomzellen der Speiseröhre durch Förderung der p53-Signalaktivität
Speiseröhrenkrebs (EC) ist ein bedeutendes globales Gesundheitsproblem und die sechsthäufigste Ursache für krebsbedingte Todesfälle. Unter seinen Subtypen ist das Plattenepithelkarzinom der Speiseröhre (ESCC) in asiatischen Ländern besonders verbreitet und macht etwa 90% aller EC-Fälle aus. Trotz Fortschritten in multimodalen Behandlungen wie Chirurgie, Strahlentherapie und Chemotherapie bleibt die 5-Jahres-Überlebensrate für ESCC mit 20% niedrig. Ein wesentlicher Faktor für diese schlechte Prognose ist die begrenzte Sensitivität oder Resistenz von ESCC gegenüber vielen Chemotherapeutika. Daher besteht ein dringender Bedarf, neue molekulare Ziele und Biomarker zu identifizieren, die die Chemosensitivität vorhersagen und die Behandlungsergebnisse verbessern können.
Epigenetische Modifikationen, insbesondere DNA-Methylierung, spielen eine entscheidende Rolle bei der Karzinogenese, indem sie Tumorsuppressorgene stilllegen. Die Hypermethylierung der Promoterregion wurde mit der Inaktivierung verschiedener Tumorsuppressorgene in EC in Verbindung gebracht, darunter TFPI-2, RARB, P16INK4a, RASSF1, APC, RUNX3, p14ARF und PRSS8. Die Untersuchung von Genen, die durch Promoter-Methylierung in ESCC reguliert werden, könnte neue Biomarker für Diagnose und Therapie aufdecken.
Das Paired Box 5 (PAX5)-Gen, das auf Chromosom 9p13 lokalisiert ist, kodiert das Pax-5-Protein, das für die B-Zell-Differenzierung und die embryonale Neuroentwicklung essentiell ist. PAX5 fungiert hauptsächlich als Tumorsuppressor, und seine Inaktivierung durch Promoter-Hypermethylierung wurde in mehreren Krebsarten beobachtet, darunter Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom, Magenkrebs, Hepatom, Brustkrebs und Lungenkrebs. Bei ESCC wurde die PAX5-Promoter-Methylierung mit schlechten Überlebensergebnissen und reduzierter Cisplatin-Sensitivität in Verbindung gebracht. Die genaue Rolle von PAX5 im Fortschreiten von ESCC bleibt jedoch unklar.
Diese Studie zielte darauf ab, die Rolle von PAX5 in ESCC durch Untersuchung seiner Expression, Methylierungsstatus und funktionellen Auswirkungen auf Zellproliferation, Apoptose und Chemosensitivität zu klären. Die Forschung umfasste acht ESCC-Zelllinien, 51 primäre ESCC-Gewebeproben und acht normale Speiseröhrenschleimhautproben. Die Daten des Cancer Genome Atlas (TCGA) wurden ebenfalls analysiert, um PAX5-Expression und Methylierungsdaten zu untersuchen.
Die PAX5-Promoter-Methylierung wurde in 37,3% (19/51) der primären ESCC-Proben nachgewiesen und war signifikant mit Alter und Tumor-Node-Metastasis (TNM)-Stadium assoziiert. Die TCGA-Datenanalyse zeigte eine inverse Korrelation zwischen PAX5-Expression und Promoter-Methylierung. Die Wiederherstellung der PAX5-Expression in ESCC-Zelllinien unterdrückte die Zellproliferation, förderte die Apoptose und hemmte das Tumorwachstum, wie in xenograftierten Mäusen bestätigt wurde. Die ektopische PAX5-Expression erhöhte signifikant die p53-Reporter-Luciferase-Aktivität und erhöhte die p53-mRNA- und Proteinspiegel. Chromatin-Immunpräzipitations-Assays bestätigten eine direkte Interaktion von PAX5 mit der p53-Promoterregion. Die Re-Expression von PAX5 sensibilisierte die ESCC-Zelllinien KYSE150 und KYSE30 für Fluorouracil und Docetaxel, während das Silencing von PAX5 in KYSE450-Zellen Resistenz induzierte.
Die Ergebnisse legen nahe, dass PAX5 als Tumorsuppressor in ESCC wirkt, indem es die Proliferation hemmt, die Apoptose fördert und die Chemosensitivität durch die Aktivierung des p53-Signalwegs erhöht. Die epigenetische Stilllegung von PAX5 trägt zum Fortschreiten von ESCC bei und macht es zu einem potenziellen therapeutischen Ziel und Chemosensitivitäts-Biomarker für die ESCC-Behandlung.
PAX5-Methylierung und Expression in ESCC
Die Studie untersuchte zunächst den Methylierungsstatus und die Expression von PAX5 in ESCC-Zelllinien und primären Tumoren. Methylierungsspezifische PCR (MSP) und Bisulfit-Sequenzierung (BSSQ) wurden verwendet, um die Promoterregion von PAX5 zu analysieren. Methylierung wurde in sieben von acht ESCC-Zelllinien nachgewiesen, wobei eine vollständige Methylierung in KYSE150, KYSE30 und TE3-Zellen beobachtet wurde. Semiquantitative Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zeigte, dass die PAX5-Expression invers mit der Promoter-Methylierung korreliert war. Die Behandlung mit dem Demethylierungsmittel 5-Aza-2′-Deoxycytidin (DAC) stellte die PAX5-Expression in KYSE150 und KYSE30-Zellen wieder her, was bestätigt, dass die PAX5-Expression durch Promoter-Methylierung reguliert wird.
In primären ESCC-Geweben wurde die PAX5-Promoter-Methylierung in 37,3% der Fälle beobachtet und war signifikant mit jüngerem Alter und fortgeschrittenem TNM-Stadium assoziiert. Die TCGA-Datenanalyse zeigte, dass die PAX5-Expression negativ mit der Promoter-Methylierung an spezifischen CpG-Stellen (cg00464519 und cg02538199) korrelierte. Obwohl keine signifikante Assoziation zwischen PAX5-Expression und dem 5-Jahres-Gesamtüberleben (OS) gefunden wurde, waren die Methylierungsniveaus des PAX5-Promoters in Krebsgeweben im Vergleich zu angrenzenden Geweben signifikant höher.
Funktionelle Auswirkungen von PAX5 auf ESCC-Zellproliferation und Apoptose
Um die tumorunterdrückende Rolle von PAX5 zu untersuchen, wurden Koloniebildungs-Assays und 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazoliumbromid (MTT)-Assays durchgeführt. Die Wiederherstellung der PAX5-Expression in KYSE150 und KYSE30-Zellen reduzierte signifikant die Anzahl der Kolonien und die Zellviabilität. Umgekehrt erhöhte der Knockdown von PAX5 in KYSE450-Zellen die Anzahl der Kolonien und die Zellviabilität. Bromodeoxyuridin (BrdU)-Proliferations-Assays bestätigten, dass die DAC-Behandlung den Prozentsatz der Zellen in der S-Phase des Zellzyklus in KYSE150 und KYSE30-Zellen reduzierte, jedoch nicht in KYSE450-Zellen, was darauf hindeutet, dass PAX5 die ESCC-Zellproliferation hemmt.
Durchflusszytometrie und Western Blot (WB)-Analyse wurden verwendet, um die Wirkung von PAX5 auf die Apoptose zu bewerten. Die Wiederherstellung der PAX5-Expression in KYSE150 und KYSE30-Zellen erhöhte den Prozentsatz der apoptotischen Zellen und erhöhte die Expression von gespaltenem Caspase-3, Caspase-7, Caspase-8, Caspase-9 und gespaltenem Poly (ADP-Ribose) Polymerase (PARP). Umgekehrt verringerte der Knockdown von PAX5 in KYSE450-Zellen die Apoptose und reduzierte diese apoptotischen Marker. Diese Ergebnisse legen nahe, dass PAX5 die Apoptose in ESCC-Zellen durch Aktivierung der Caspase-Kaskade fördert.
In-vivo-tumorunterdrückende Wirkung von PAX5
Die tumorunterdrückende Wirkung von PAX5 wurde weiterhin in vivo anhand von xenograftierten Mausmodellen validiert. KYSE150 und KYSE30-Zellen, die stabil mit PAX5 oder einem leeren Vektor transfiziert wurden, wurden subkutan in Nacktmäuse injiziert. Die PAX5-Expression reduzierte signifikant das Tumorvolumen und das Gewicht im Vergleich zur Kontrollgruppe. Terminale Desoxynukleotidyltransferase-vermittelte Deoxyuridintriphosphat (dUTP)-Digoxigenin-Nick-End-Labeling (TUNEL)-Assays zeigten einen höheren Prozentsatz apoptotischer Zellen in PAX5-exprimierenden Tumoren. Immunhistochemische (IHC)-Färbung bestätigte, dass die PAX5-Expression positiv mit der p53-Expression in xenograftierten Tumoren korrelierte, was darauf hindeutet, dass PAX5 die Apoptose in vivo durch den p53-Signalweg fördert.
PAX5 aktiviert den p53-Signalweg
Die Studie untersuchte den Mechanismus, durch den PAX5 seine tumorunterdrückenden Wirkungen ausübt. Dual-Luciferase-Reporter-Assays zeigten, dass die ektopische Expression von PAX5 die p53-Reporter-Luciferase-Aktivität in KYSE150 und KYSE30-Zellen erhöhte. Chromatin-Immunpräzipitations (ChIP)-Assays bestätigten, dass PAX5 an die p53-Promoterregion bindet, was darauf hindeutet, dass PAX5 die p53-Expression transkriptionell hochreguliert. Quantitative RT-PCR zeigte, dass die PAX5-Expression die p53-mRNA-Spiegel in KYSE150 und KYSE30-Zellen signifikant erhöhte, während der Knockdown von PAX5 in KYSE450-Zellen die p53-mRNA-Spiegel reduzierte. Diese Ergebnisse legen nahe, dass PAX5 den p53-Signalweg aktiviert, indem es direkt an den p53-Promoter bindet und dessen Transkription verstärkt.
PAX5 erhöht die Chemosensitivität in ESCC-Zellen
Die Studie untersuchte auch die Auswirkungen von PAX5 auf die Chemosensitivität von ESCC-Zellen. MTT-Assays wurden verwendet, um die halbmaximale Inhibitionskonzentration (IC50) von Fluorouracil (5-FU) und Docetaxel in ESCC-Zellen mit oder ohne PAX5-Expression zu bestimmen. Die Wiederherstellung der PAX5-Expression in KYSE150 und KYSE30-Zellen reduzierte signifikant die IC50-Werte von 5-FU und Docetaxel, was auf eine erhöhte Chemosensitivität hinweist. Umgekehrt erhöhte der Knockdown von PAX5 in KYSE450-Zellen die IC50-Werte, was auf eine induzierte Resistenz gegenüber diesen Chemotherapeutika hindeutet.
Um die Beteiligung des p53-Signalwegs an der PAX5-induzierten Chemosensitivität zu bestätigen, wurde der p53-Inhibitor Pifithrin-m verwendet. Die Behandlung mit Pifithrin-m erhöhte die IC50-Werte von 5-FU und Docetaxel in PAX5-exprimierenden KYSE150 und KYSE30-Zellen, obwohl diese Werte niedriger blieben als in der Kontrollgruppe. Diese Ergebnisse zeigen, dass PAX5 die Chemosensitivität in ESCC-Zellen durch Aktivierung des p53-Signalwegs erhöht.
Zusammenfassung
Zusammenfassend fungiert PAX5 als Tumorsuppressor in ESCC, indem es die Zellproliferation hemmt, die Apoptose fördert und die Chemosensitivität durch die Aktivierung des p53-Signalwegs erhöht. Die epigenetische Stilllegung von PAX5 trägt zum Fortschreiten von ESCC bei und macht es zu einem potenziellen therapeutischen Ziel und Chemosensitivitäts-Biomarker für die ESCC-Behandlung. Die Ergebnisse dieser Studie bieten wertvolle Einblicke in die molekularen Mechanismen, die ESCC zugrunde liegen, und heben das Potenzial von PAX5 als neuartiges therapeutisches Ziel hervor.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000002018