Telomerase-vermittelte Immortalisierung von humanen Vaginalwandfibroblasten von Patientinnen mit Beckenorganprolaps
Der Beckenorganprolaps (POP) ist eine weit verbreitete Erkrankung bei Frauen, die durch eine Dysfunktion der stützenden Gewebe des Beckenbodens gekennzeichnet ist. Die Inzidenz von POP liegt zwischen 3,40 % und 10,76 %, wobei chirurgische Eingriffe die primäre Behandlungsmethode darstellen. Komplikationen im Zusammenhang mit transvaginalen Netzen (TVM) führten jedoch 2019 zu deren Verbot durch die FDA, was Forscher dazu veranlasste, das Tissue Engineering als Alternative zu erforschen. Fibroblasten spielen eine entscheidende Rolle bei der Remodellierung der extrazellulären Matrix (ECM), einem Schlüsselmechanismus bei POP. Die begrenzte Passagierungsfähigkeit von humanen Vaginalwandfibroblasten (hVWFs) in vitro stellt jedoch eine erhebliche Herausforderung für Forschung und therapeutische Anwendungen dar. Diese Studie zielte darauf ab, hVWFs durch die Einführung der humanen Telomerase-Reverse-Transkriptase (hTERT) zu immortalisierten, um diese Einschränkungen zu überwinden.
Die Studie wurde gemäß der Deklaration von Helsinki durchgeführt und von der Ethikkommission der Institution genehmigt. Vaginalwandgewebe wurden von Patientinnen gesammelt, die sich einer Operation wegen eines vorderen Vaginalwandprolaps unterzogen. Primäre hVWFs wurden isoliert und kultiviert, wobei die zelluläre Seneszenz durch Seneszenz-assoziierte β-Galaktosidase (SA-β-gal)-Färbung nachgewiesen wurde. Lentivirale Transfektionsvektoren wurden verwendet, um hTERT stabil in hVWFs der Passage 3 zu exprimieren, wodurch immortalisierten hVWFs (i-hVWFs) generiert wurden. Die zelluläre Proliferation wurde mittels CCK-8- und EdU-Assays bewertet, während die zelluläre Migration durch Wundheilungsassays untersucht wurde. Die chromosomale Stabilität wurde mittels G-Banden-Chromosomen-Karyotypanalyse bewertet, und das tumorigene Potenzial wurde in vivo in Nacktmäusen untersucht.
Die Ergebnisse zeigten, dass primäre hVWFs ab der siebten Passage eine signifikante Seneszenz aufwiesen. Bis zur elften Passage zeigten hVWFs einen signifikant höheren Seneszenzanteil im Vergleich zu i-hVWFs. Die immortalisierten Zellen behielten während kontinuierlicher Passagierung eine stabile Proliferation, Migrationsfähigkeit, Expression von ECM-regulierenden Genen und Chromosomenkaryotyp bei. Wichtig ist, dass i-hVWFs in vivo kein tumorigenes Potenzial aufwiesen.
Die Isolierung und Kultivierung von primären hVWFs zeigte, dass diese Zellen über 16-18 Passagen seriell kultiviert werden konnten, wobei die Seneszenz progressiv zunahm. Die SA-β-gal-Färbung bestätigte, dass der Anteil seneszierter Zellen ab der siebten Passage signifikant anstieg und bis zur 18. Passage nahezu 100 % erreichte. Im Gegensatz dazu wiesen i-hVWFs ab der elften Passage einen stabilen Seneszenzanteil zwischen 12,8 % und 15,4 % auf, was auf eine erfolgreiche Immortalisierung hinweist.
Die Überexpression von hTERT in hVWFs wurde durch RT-qPCR und Western Blot bestätigt. Die hTERT-mRNA-Expression war in hVWFs negativ, jedoch in i-hVWFs positiv, wobei die Proteinspiegel in i-hVWFs 18,36-fach höher waren. Die Immunfluoreszenzfärbung lokalisierte das hTERT-Protein im Zellkern, was mit seiner Rolle bei der Telomererhaltung übereinstimmt.
Proliferations- und Migrationsassays zeigten, dass i-hVWFs funktionelle Merkmale beibehielten, die denen primärer hVWFs ähneln. In der fünften Passage wurden keine signifikanten Unterschiede in der Proliferation oder Migration zwischen hVWFs und i-hVWFs beobachtet. Bis zur elften Passage zeigten i-hVWFs jedoch signifikant höhere Proliferations- und Migrationsraten im Vergleich zu hVWFs. Die kontinuierliche Passagierung von i-hVWFs bis zur 30. Passage ergab stabile Proliferations- und Migrationsfähigkeiten, was die Robustheit des Immortalisierungsprozesses unterstreicht.
Die Expression von ECM-regulierenden Genen, einschließlich COL1A1, COL3A1, ELN, MMP2, MMP3, MMP9, TIMP1 und TIMP2, wurde in i-hVWFs untersucht. Sowohl RT-qPCR als auch Western Blot bestätigten eine stabile Expression dieser Gene über die Passagen 5, 10, 20 und 30, was darauf hinweist, dass die hTERT-Immortalisierung die Schlüsselattribute der hVWFs nicht veränderte.
Die chromosomale Stabilität wurde mittels G-Banden-Chromosomen-Karyotypanalyse bewertet, die in hVWFs und i-hVWFs einen normalen weiblichen Karyotyp ergab. Dieser Befund unterstreicht die genetische Stabilität der immortalisierten Zellen, ein entscheidender Faktor für ihre Verwendung in Forschung und therapeutischen Anwendungen.
In vivo-Tumorigenese-Assays wurden durchgeführt, um die Sicherheit von i-hVWFs zu bewerten. Die subkutane Injektion von i-hVWFs in Nacktmäuse führte nicht zur Tumorbildung, während Kontrollinjektionen von HeLa-Zellen in allen Fällen zur Tumorentwicklung führten. Das Fehlen eines tumorigenen Potenzials unterstützt weiterhin die Sicherheit und Eignung von i-hVWFs für zukünftige Studien.
Die Ergebnisse dieser Studie unterstreichen das Potenzial der hTERT-vermittelten Immortalisierung, die mit primären hVWFs verbundenen Einschränkungen zu überwinden. Durch die Verlängerung der Lebensdauer dieser Zellen bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung ihrer funktionellen und genetischen Stabilität bieten i-hVWFs ein wertvolles Modell für die Erforschung von POP und die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien. Die Fähigkeit, eine konsistente und reproduzierbare Zelllinie von Patientinnen mit POP zu generieren, adressiert die Herausforderungen der zellulären Heterogenität und der begrenzten Verfügbarkeit von chirurgischen Proben.
Zusammenfassend gelang es dieser Studie, hVWFs von Patientinnen mit POP durch die Einführung von hTERT erfolgreich zu immortalisierten. Die immortalisierten Zellen zeigten eine stabile Proliferation, Migration und Expression von ECM-regulierenden Genen sowie einen normalen Chromosomenkaryotyp und kein tumorigenes Potenzial. Diese Eigenschaften machen i-hVWFs zu einem vielversprechenden Werkzeug für die Weiterentwicklung der POP-Forschung und die Erforschung neuer Behandlungsoptionen. Die Entwicklung dieser immortalisierten Zelllinie stellt einen bedeutenden Fortschritt im Verständnis der Pathophysiologie von POP und der Verbesserung der Patientenergebnisse dar.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000002278