TOSO interagiert mit SYK und verstärkt die Aktivierung des BCR-Signalwegs bei der chronischen lymphatischen Leukämie
Die chronische lymphatische Leukämie (CLL) ist die häufigste leukämische Erkrankung in der westlichen Hemisphäre und durch die Akkumulation reifer B-Zellen im Blut, Knochenmark und lymphoiden Organen charakterisiert. CLL gilt als prototypische antigengetriebene Leukämie/Lymphom, wobei chronische Antigenstimulation eine zentrale Rolle in der Pathogenese spielt. Der B-Zell-Rezeptor (BCR) ist der Hauptrezeptor für die Weiterleitung extrinsischer Stimulation, und der BCR-Signalweg zeigt eine konstitutive Aktivierung in CLL. Starke Evidenz deutet darauf hin, dass die BCR-Signalübertragung sowohl die Entwicklung der CLL als auch das klinische Verhalten maßgeblich beeinflusst. Patienten mit somatischen Mutationen im Immunglobulin-Schwerketten-Variablengen (IGHV) weisen im Vergleich zu Patienten mit unmutierter IGHV-Konfiguration einen indolenteren Krankheitsverlauf und längeres Überleben auf. CLL-Zellen exprimieren Merkmale antigen-erfahrener B-Zellen, darunter ein verzerrtes IGHV-Genrepertoire und BCRs mit strukturell ähnlichen Antigen-Bindungsstellen, die als konservierte „stereotypische“ Immunglobulin-Variableregionen definiert sind. Die Antigen-Antikörper-Reaktion wird durch die Bindung von Immunglobulinen an Antigene über ihre variablen Aminotermini und an Effektormoleküle wie Fc-Rezeptoren (FcRs) über ihre konstanten Carboxytermini vermittelt. Die Interaktion zwischen FcRs und Antikörpern initiiert vielfältige Effektorfunktionen, die für die Abwehr von Pathogenen entscheidend sind. Verschiedene FcRs sind für Immunglobulin G (IgG; FcgRI, FcgRII, FcgRIII), IgE (FceR) und IgA (FcaR) identifiziert worden. IgM ist der erste Antikörper-Isotyp, der während der Immunantwort auf Pathogene oder Autoantigene gebildet wird. Der IgM-Fc-Rezeptor (FcmR) wurde jedoch erst kürzlich identifiziert und mit TOSO (auch bekannt als Fas-inhibitorisches Molekül 3, FAIM3) gleichgesetzt. Frühere Studien unserer und anderer Gruppen zeigten, dass TOSO/FcmR in CLL-Zellen im Vergleich zu normalen B-Zellen und anderen B-Zell-Lymphomen selektiv hochreguliert ist. Seine Funktion in CLL bleibt jedoch unklar. Strukturanalysen von TOSO/FcmR deuten auf einen langen zytoplasmatischen Schwanz (118 Aminosäuren) mit konservierten Resten hin, der sich von anderen FcRs unterscheidet. Die Bindung von IgM an TOSO/FcmR auf natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) induziert die Phosphorylierung von PLCg und Erk1/2. Wir postulierten, dass TOSO mit Proteinen interagiert, die in malignen B-Zellen hochregulierte Signalwege steuern. Diese Studie zielte darauf ab, neue Interaktionspartner von TOSO zu identifizieren und seine Rolle in der CLL-Onkogenese zu entschlüsseln.
Methoden
Die ethische Genehmigung wurde gemäß der Deklaration von Helsinki eingeholt, und alle Patienten unterzeichneten eine informierte Einwilligung. Menschliche Non-Hodgkin-Lymphom-B-Zelllinien (Granta-519, Z138) und primäre B-Lymphozyten von neun CLL-Patienten wurden verwendet. CD19+-B-Zellen wurden mittels magnetischer Antikörper-basierter Anreicherung isoliert (>98% Reinheit). Die Zelllinien wurden in Iscove- bzw. Dulbecco-Medium mit 10% fötalem Kälberserum kultiviert. Die BCR-Stimulation erfolgte durch Zugabe von anti-human-IgM F(ab‘)2-Fragmenten (10 µg/ml, 6–24 h).
Die Voll-Längen-TOSO-cDNA wurde in den pLenti6.3_Vektor kloniert und mittels Lentivirus-Transduktion in Granta-519- und Z138-Zellen exprimiert. Die TOSO-Expression wurde mittels qRT-PCR und Western Blot verifiziert. Für die Knockdown-Experimente wurden siRNA-Moleküle in primäre CLL-Zellen transfiziert.
Proteinextrakte wurden für Co-Immunopräzipitation (Co-IP) und Massenspektrometrie aufgearbeitet. Die Interaktion zwischen TOSO und SYK wurde durch Co-IP bestätigt. Die Phosphorylierung von SYK und downstreamen Signalproteinen (NF-κB, MAPK) wurde mittels Western Blot analysiert. Die Apoptoserate wurde durch Annexin-V-Färbung und Flusszytometrie quantifiziert.
Ergebnisse
Die Überexpression von TOSO führte in Granta-519-, Z138- und primären CLL-Zellen zu erhöhter SYK-Phosphorylierung (p-SYK). Die Behandlung mit dem SYK-Inhibitor R788 reduzierte die TOSO-SYK-Interaktion signifikant. In TOSO-überexprimierenden Zellen wurden zudem erhöhte Phosphorylierungsniveaus von IκBα, p65 (NF-κB), ERK und p38 (MAPK) nach BCR-Stimulation beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigten TOSO-knockdown-Zellen reduzierte Aktivierung dieser Signalwege.
TOSO-überexprimierende Zellen wiesen eine signifikant geringere Apoptoserate nach anti-IgM-Stimulation auf (8,46 ± 2,90 % vs. 25,20 ± 4,60 % in Kontrollen; p < 0,05). Der TOSO-Knockdown erhöhte die Apoptose in primären CLL-Zellen. Zudem korrelierte die TOSO-Expression positiv mit der BCL-2-Expression: TOSO-Überexpression erhöhte, der Knockdown reduzierte BCL-2.
Diskussion
Diese Studie zeigt, dass TOSO durch Interaktion mit SYK die BCR-Signalübertragung in CLL-Zellen verstärkt. Die Bindung von TOSO an SYK fördert dessen Phosphorylierung und aktiviert downstream-Signalwege wie NF-κB und MAPK, die für Proliferation und Apoptoseresistenz entscheidend sind. Die Assoziation von TOSO-Überexpression mit unmutierter IGHV-Konfiguration unterstreicht seine Rolle in der Pathogenese antigengetriebener CLL-Varianten.
Die Beobachtung, dass TOSO die BCL-2-Expression reguliert, liefert einen Mechanismus für die Apoptoseresistenz in CLL. Die hohe TOSO-Expression spezifisch in malignen B-Zellen macht es zu einem attraktiven Ziel für therapeutische Interventionen, z.B. durch CAR-T-Zell-Therapie oder small-molecule-Inhibitoren.
Ungeklärt bleibt, wie TOSO die SYK-Phosphorylierung mechanistisch beeinflusst und ob weitere Interaktionspartner beteiligt sind. Zukünftige Studien sollten zudem die Regulation von BCL-2 durch TOSO aufklären.
Zusammenfassend demonstrieren wir, dass TOSO über die SYK-vermittelte BCR-Aktivierung und BCL-2-Hochregulation zur malignen Transformation und Therapieresistenz in CLL beiträgt.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000000999