Unfraktioniertes Heparin reduziert die endotheliale Barrieredysfunktion über den Phosphatidylinositol-3-Kinase/Serin/Threonin-Kinase/Nuklearfaktor Kappa-B-Signalweg
Die akute Lungenschädigung (ALI) ist ein kritischer Zustand, der durch eine übermäßige Entzündung in der Lunge gekennzeichnet ist und zu einer hohen Morbidität und Mortalität führt. Trotz umfangreicher Forschung sind wirksame Therapien für ALI nach wie vor begrenzt. Ein Schlüsselmerkmal von ALI ist die Störung der pulmonalen endothelialen Barriere, die zu einer vaskulären Hyperpermeabilität und einem Lungenödem führt. Adhärenzverbindungen, die auf dem vaskulären endothelialen Cadherin (VE-Cadherin) basieren, spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der endothelialen Permeabilität. Lipopolysaccharid (LPS), ein Bestandteil gramnegativer Bakterien, induziert eine endotheliale Hyperpermeabilität, indem es die VE-Cadherin-vermittelten Zell-Zell-Verbindungen stört. Unfraktioniertes Heparin (UFH), ein häufig verwendetes Antikoagulans, hat gezeigt, dass es die endotheliale Barrierefunktion verbessert, aber die zugrunde liegenden Mechanismen sind noch nicht vollständig verstanden. Diese Studie untersucht die schützenden Wirkungen von UFH auf die LPS-induzierte endotheliale Barrieredysfunktion und erforscht die Beteiligung des Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K)/Serin/Threonin-Kinase (Akt)/Nuklearfaktor Kappa-B (NF-κB)-Signalwegs.
Methoden
Tierstudien
Männliche C57BL/6-Mäuse wurden in drei Gruppen eingeteilt: Fahrzeug, LPS und LPS + UFH. LPS (30 mg/kg) wurde intraperitoneal verabreicht, um eine Sepsis zu induzieren. Mäuse in der LPS + UFH-Gruppe erhielten 30 Minuten vor der LPS-Verabreichung eine subkutane Injektion von 8 U UFH. Sechs Stunden nach der LPS-Injektion wurde Lungengewebe entnommen, um die Lungenschädigung anhand des Lungennass-/Trockengewichtsverhältnisses (W/D) und der histologischen Analyse zu bewerten. Die bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit (BALF) wurde auf Proteinkonzentration, Gesamtzellzahl, den Prozentsatz polymorphkerniger Neutrophiler (PMN) und den Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α)-Spiegel analysiert.
Zellkultur und Behandlung
Humane pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellen (HPMECs) wurden kultiviert und mit LPS (10 µg/mL) oder TNF-α (10 ng/mL) behandelt, um eine endotheliale Barrieredysfunktion zu induzieren. UFH (10 U/mL) wurde 30 Minuten vor der LPS- oder TNF-α-Stimulation hinzugefügt. Die transendotheliale elektrische Resistenz (TEER) und die Fluoresceinisothiocyanat-Dextran (FITC-Dextran)-Permeabilitätsassays wurden durchgeführt, um die endotheliale Barrierefunktion zu messen. Immunfluoreszenzfärbung und Western-Blot-Analyse wurden verwendet, um die Expression von VE-Cadherin, p120-Catenin, phosphoryliertem Myosin-Leichtketten (p-MLC) und F-Aktin-Remodellierung zu bewerten. Die Aktivierung des PI3K/Akt/NF-κB-Signalwegs wurde durch Messung der Phosphorylierung von Akt, IκB-Kinase (IKK) und der nuklearen Translokation von NF-κB bewertet.
Ergebnisse
UFH reduziert die LPS-induzierte endotheliale Barrieredysfunktion in vivo
Die histopathologische Analyse zeigte, dass LPS signifikante Lungenschäden induzierte, einschließlich Neutrophileninfiltration, Erythrozytenausschwemmung, Alveolarkollaps und Septumverdickung. Die UFH-Vorbehandlung reduzierte diese pathologischen Veränderungen deutlich. Das Lungennass-/Trockengewichtsverhältnis, ein Maß für das Lungenödem, war in der LPS + UFH-Gruppe signifikant niedriger als in der LPS-Gruppe (5,05 ± 0,18 vs. 6,93 ± 0,20, P = 0,0022). UFH verringerte auch die Proteinkonzentration (0,32 ± 0,04 vs. 0,57 ± 0,04 mg/mL, P = 0,0092), die Gesamtzellzahl (3,65 ± 0,78 vs. 9,57 ± 1,23 × 10^5/mL, P = 0,0155), den PMN-Prozentsatz (22,20% ± 3,92% vs. 88,05% ± 2,88%, P = 0,0002) und die TNF-α-Spiegel (189,33 ± 14,19 vs. 460,33 ± 23,48 pg/mL, P = 0,0006) in der BALF. Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass UFH den LPS-induzierten Rückgang der Membranexpression von VE-Cadherin und p120-Catenin im Lungengewebe verhinderte.
UFH reduziert die LPS- oder TNF-α-induzierte Hyperpermeabilität in vitro
LPS und TNF-α reduzierten die TEER signifikant und erhöhten die FITC-Dextran-Permeabilität in HPMECs, was auf eine endotheliale Barrieredysfunktion hinweist. Die UFH-Vorbehandlung erhöhte die TEER (LPS + UFH: 15,84 ± 1,09 vs. LPS: 8,90 ± 0,66 V·cm², P = 0,0056; TNF-α + UFH: 18,15 ± 0,98 vs. TNF-α: 11,28 ± 0,64 V·cm², P = 0,0042) und verringerte die FITC-Dextran-Permeabilität (LPS + UFH: 39,70 ± 1,98 vs. LPS: 56,25 ± 1,51, P = 0,0027; TNF-α + UFH: 36,51 ± 1,20 vs. TNF-α: 55,42 ± 1,42, P = 0,0005). Immunfluoreszenzfärbung und Western-Blot-Analyse zeigten, dass UFH den LPS- oder TNF-α-induzierten Rückgang der Membranexpression von VE-Cadherin und p120-Catenin verhinderte, die p-MLC-Expression reduzierte und das F-Aktin-Remodellierung hemmte.
UFH hemmt die LPS-induzierte Aktivierung des PI3K/Akt/NF-κB-Signalwegs
Die LPS-Stimulation erhöhte die Phosphorylierung von Akt und IKK und förderte die nukleare Translokation von NF-κB in HPMECs. Die UFH-Vorbehandlung reduzierte signifikant die Expression von p-Akt (LPS + UFH: 0,466 ± 0,035 vs. LPS: 0,977 ± 0,081, P = 0,0045), p-IKK (LPS + UFH: 0,578 ± 0,044 vs. LPS: 1,023 ± 0,070, P = 0,0060) und die nukleare Translokation von NF-κB (LPS + UFH: 0,503 ± 0,065 vs. LPS: 1,003 ± 0,077, P = 0,0078). Ähnliche Effekte wurden mit dem PI3K-Inhibitor Wortmannin beobachtet, was darauf hindeutet, dass die schützenden Wirkungen von UFH über den PI3K/Akt/NF-κB-Signalweg vermittelt werden.
Diskussion
Diese Studie zeigt, dass UFH die LPS-induzierte endotheliale Barrieredysfunktion abschwächt, indem es VE-Cadherin stabilisiert und den PI3K/Akt/NF-κB-Signalweg hemmt. VE-Cadherin-basierte Adhärenzverbindungen sind entscheidend für die Aufrechterhaltung der endothelialen Barriereintegrität. LPS und TNF-α stören diese Verbindungen, indem sie die VE-Cadherin-Internalisierung induzieren, was zu einer endothelialen Hyperpermeabilität führt. UFH verhindert diese Störung, indem es die Membranexpression von VE-Cadherin und p120-Catenin aufrechterhält, die p-MLC-Expression reduziert und das F-Aktin-Remodellierung hemmt.
Der PI3K/Akt/NF-κB-Signalweg spielt eine zentrale Rolle bei der Regulierung der endothelialen Barrierefunktion. LPS aktiviert diesen Signalweg, was zu einer erhöhten Phosphorylierung von Akt und IKK sowie zur nuklearen Translokation von NF-κB führt, was Entzündungen und endotheliale Schäden fördert. UFH hemmt diesen Signalweg und reduziert somit die endotheliale Hyperpermeabilität und Entzündung. Die Ergebnisse stimmen mit früheren Studien überein, die zeigen, dass UFH die LPS-induzierte Interleukin-8 (IL-8)-Sekretion und die endotheliale Barrieredysfunktion über den PI3K/Akt/NF-κB-Signalweg abschwächt.
Zusammenfassend schützt UFH vor der LPS-induzierten endothelialen Barrieredysfunktion, indem es VE-Cadherin stabilisiert und den PI3K/Akt/NF-κB-Signalweg hemmt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass UFH therapeutisches Potenzial für ALI und andere Zustände, die durch eine endotheliale Barrieredysfunktion gekennzeichnet sind, haben könnte. Zukünftige Studien sollten die Wirkungen von UFH in klinischen Settings untersuchen und sein Potenzial als Behandlung für ALI erforschen.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000000905